集成核酸提取的实时荧光PCR微全分析系统.pdf

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1、第42卷分析化学(FENXInUAXUE)研究报告第1O期2014年1O月ChineseJournalofAnalyticalChemistry1393—1399DOI：10．11895／j．issn．0253-3820·140358集成核酸提取的实时荧光PCR微全分析系统赵树弥朱灵，2朱灿灿李阳王华东张龙堵棣威邓国庆，王安刘勇(中国科学院安徽光学精密机械研究所，安徽省生物医学光学仪器工程技术研究中心，合肥230031)(皖江新兴产业技术发展中心，铜陵244000)摘要集成核酸提取的实时荧光PCR微全

2、分析系统将核酸提取、PCR扩增与实时荧光检测进行整合，在同一块微流控芯片上实现了核酸分析过程的全自动和全封闭，具有试剂用量少、分析速度快、操作简便等优点。本研究采用微机械加工技术制作集成核酸提取微流控芯片的阳极模，使用组合模具法和注塑法制作具有3D通道的PDMS基片，与玻璃基底通过等离子体键合封装成集成核酸提取芯片。构建了由微流体速度可调节(0～10mL／min)的驱动控制装置、温控精度可达0．1℃的TEC温控平台、CCD检测功能模块等组成的微全分析系统。以人类血液裂解液为样品，采用硅胶膜进行芯片上核

3、酸提取。系统根据设置好的时序自动执行，以2mL／min的流体驱动速度完成20裂解液上样、清洗；以1mL／min的流体驱动速度完成DNA洗脱，抽取PCR试剂与之混合注入到反应腔。提取的基因组DNA以链上内参基因GAPDH为检测对象，并以传统手工提取为对照，在该系统平台上进行PCR扩增和熔解曲线分析实验。片上PCR扩增结果显示，扩增曲线明显，Ct值分别为25．3和26．9。扩增产物进行熔解曲线分析得到的熔解温度一致，均为89．9。结果表明，此系统能够自动化、全封闭的在微流控芯片上完成核酸提取、PCR扩增与

4、实时定量分析。关键词核酸提取；微全分析系统；实时荧光PCR；微流控芯片1引言核酸作为基本的遗传物质，携带着各种信息，对其结构、功能的认识，有利于研究物种的遗传、进化以及疾病诊断等。微流控芯片在核酸分析方面有着广泛和极其重要的应用，如基因突变检测]、病原体基因鉴定、SNP(Singlenucleotidepolymorphism)分析等。传统的PCR(Polymerasechainreac．tion)技术虽然能实现DNA的扩增检测，但其检测结果受人为因素的影响较大，需要专业技术人员和实验室设备，而荧光定

5、量PCR技术和微流控技术的相结合，能实现核酸操作过程的自动化、全封闭，简化了人工的操作过程，避免了过程污染，提高了核酸检测的效率和准确性圳。集成核酸提取功能的实时荧光PCR微全分析系统将样品前处理、PCR扩增与荧光检测功能模块集成，能直接给出分析结果，可实现“样品进一结果出”这一目标。因此，微全分析系统现已成为分析仪器和分析科学发展的重要方向和前沿¨。集成化的微流控芯片通常将微流体控制与分析单元集成在芯片上，如微泵、微阀、微加热器、微混合器、微流量控制器以及微检测器等，使体积微型化和功能集成化，在较短

6、时间内精确完成从样品制备到结果显示的全部过程H。尽管大规模集成的微全分析系统还处在实验室研究阶段，但随着微流控芯片的运用与发展¨n”，针对特定功能的微流控芯片及系统发展迅速[1]，如静态腔式微流控PCR系统、具有样品前处理功能的核酸提取系统[2、集成化的温控系统、微型化的检测系统。目前，由于各功能模块的研究突破，促进了集成化的发展，但形成一个完整的集成化系统还存在着很大的技术难度。本实验基于固相萃取法，采用硅胶膜提取核酸，设计并制作了集成核酸提取的微流控芯片。使用自主研发的实时荧光PCR微全分析系统，

7、成功提取了人全血中的基因组DNA，对基因组上稳定表2014-04-22收稿；2014-06—15接受本文系中国科学院战略性先导科技专项基金(No．XDA08040109)资助项目E—mail：liuyongcas@gmail．corn分析化学第42卷达的内参基因甘油醛．3．磷酸脱氢酶(GAPDH)进行PCR扩增检测。开展了传统手工提取核酸的对照试验，通过对比，验证了集成核酸提取的实时荧光PCR微全分析系统的可行性，实现了在同一块微流控芯片上完成核酸的提取与分析过程。2实验部分2．1芯片设计与制作通过微

8、机械加工技术在一个很小体积的金属块上加工各种微小型腔体，然后把它们作为一个镶块嵌入模板并进行整体组装，组装成的模具示意图如图1A所示，模具尺寸为40mmx50mmxl0mm，制作芯片的实物如图1B所示。C1是BufferAwl试剂腔，c2是BufferAw2试剂腔，C4是AE试剂腔，c5是PCR反应试剂腔，c1～c3的体积均为110L，C4～C6的体积均为50txL；E是50L的提取腔；w是224L的废液腔；M是5OL的混合腔；扁平形的PCR反应腔体积为