溶菌酶的晶体培养实验.doc

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1、溶菌酶晶体培养实验一・实验目的近年来，X射线晶体结构分析技术在受体研究小得到了广泛应用。其关键是获得具有高衍射分辨率的晶体。本试验通过溶菌酶晶体培养试验：1.了解蛋白质分子结晶的原理2.了解影响蛋白质分子结晶的因索3.掌握蛋白质晶体的悬滴培养法二.蛋白质分子结晶的原理proteinconcentrationparameter,e.g.saltconcentrationFigure1.1.Atypicalsolubilitycurveforaprotein,asafunctionofthesaltconcentr

2、ationoranotherparameter.Forbestresults,thecrystalsshouldbegrowna(alowerlevelofsupersaturationthanisrequiredforformationofnuclei.蛋白质结晶的4个主要步骤：1.测定蛋白质溶液的纯度2.蛋白质溶液与盐，有机化合物等沉淀剂混匀；膜蛋白需要加入去垢剂3.混合溶液达到过饱和状态，形成晶核4.晶核一旦形成，晶体开始生长三.影响蛋白质分子结晶的因素1.待结晶蛋白质的纯度，一般要求纯度高于95%2•待

3、结晶蛋白质的浓度，5〜10mg/ml3.沉淀剂，盐，PEG,有机溶剂4.pH值5.温度，4°C,16°C6.结晶方法，悬滴法，坐滴法7.震动U!・试剂及器材1・试剂：溶菌酶蛋白，氯化钠，醋酸钠，去离子水1.器材：可调移液器，晶体培养板，硅化盖玻片，真空脂，晶体培养箱，显微镜五.试验步骤1.配制50mg/ml溶菌酶溶液,0.1M醋酸钠溶液,pH4.52.配制池液：(1)5%(w/v)氯化钠，0.1M醋酸钠溶液,pH4.5(2)8%(w/v)氯化钠，0.1M醋酸钠溶液，pH4.53.在晶体培养板溶剂池屮分别加入0.

4、3ml池液(1)和池液(2)4.在干净的硅化盖玻片上，滴加2口1溶菌酶溶液和2口1池液5.将盖玻片倒扣在加池液的有溶剂池JL,用真空脂密封6.将晶体培养板放入16°C晶体培养箱7.第二天，在显微镜下观察晶体生长情况Figure1.3.Thehangingdropmethodofproteincrystallization.Usingatraywithdepressions.theproteinsolutioninsuspendedasadropfromaglasscoverslipabove(heprecip

5、itantsolutioninasealeddepression.Theglassslipissiliconizedtopreventspreadingofthedrop.Equilibriumisreachedbydiffusionofvaporfromthedroptotheprecipitatingsolutionorviceversa・Allofthedepressionsinthetraycan.ofcourse,beused.ProcedureforCrystallizationofLysozyme

6、Chemicalsneeded:LysozymeproteinSodiumChlorideSodiumAcetatebufferDistilledwaterProcedure1.Prepare50mg/mlsampleoflysozymein0.1MNaAcpH4.52.Preparewellsolutions:a.5%(w/v)NaCl,0.1Msodiumacetate,pH4.5b.8%(w/v)NaCl,0.1Msodiumacetate,pH4.53.Place0.3mlofwellsolutiona

7、,wellsolutionbineachwellofaVDXtray4.Onacleansilatedcoverslide,create4dropsof2

8、illysozymesolution,2glwellsolution5.Sealthesecoverslipswithgreaseoverawell6.PlacetheVDXplatein16°Cincubatoi*.7.Observethecrystalsnextdayundermicroscope