淀粉酶固定化实验方案.doc

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1、实验三、a-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测一、实验背景：酶:生物体内活细胞产生的具有催化作用的有机物。在21世纪，酶已经大规模地应用于食品、化工、轻纺、医药等各个领域：•果汁制作（果胶酶分解细胞壁，促进果汁生成。）・加酶洗衣粉（某些酶对污渍的作用一般碱性物质更大）•根据体内酶活性变化检测疾病（淀粉酶的活性大小可休现胰脏、肾脏的功能）固定化酶：将水溶性酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。直接使用酶缺点固定化酶优点通常对强酸、强碱、高温和有机溶剂等条件非常敏感，容易失活固定化酶提高了酶的稳

2、定性，可较长时间地储存和使用；（更能耐受温度、PH的变化）溶液中的酶很难冋收，不能被再次利用，提高了生产成本固定化酚町以被反复使用，更经济，更利于生产反应后会混在产物中，可能影响产品质量（难分离）酶既能与反应物接触，乂能与产物分离纯化固定化酶载体应具备以下要求大体上有：1）在酶催化反应过程的惰性：载体应不与底物、产物及介质发生反应。2）有良好的渗透性：制备成柱子后，能使底物和产物能快速通过减少吸附。3）有生物亲和性和相容性，有利于酶活力发挥和稳定。4）有较高酶负载量，载体农血能提供多个活性位点利于酶分子偶联。二、实验原理:•般

3、酶的固定化方法：吸附法、共价偶联法、交联法、包理法。1、一般酶固定化的传统：吸附法、共价偶联法、交联法、包埋法。吸附法利用各种吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其衣面上血使酶固定的方法。通當有物理吸附法和离子吸附法。常'用吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等。采用吸附法固定酶，其操作简便、条件温和，不会引起酶变性或失活，□载体廉价易得，可反复使用。包埋法包埋I古I定化法是把酶固定聚合物材料的格子结构或微囊结构等多空载体中，而底物仍能渗入格子或微囊内与酶相接他。这个方法比较简便，酶分子仅仅是被包埋起来，酶生物活性被破坏的

4、程度低，但此法对大分子底物不适用。包埋法制备固定化酶除包埋水溶性酶外还曲包埋细胞，制成固定化细胞，例如可用明胶及戊二醛包埋具有青霉素酰化酶活力的菌体，可连续水解帑基青霉素，工业生产6-氨基青霉烷酸。结合法酶蛋白分子上与不溶性固相支持物表而上通过离子键结合而使酶固定的方法，叫离子键结合法。其间形成化学共价键结合的固定化方法叫共价键结合法。共价键结合法结合力牢固，使用过程中不易发生酶的脱落，稳定性能好。该法的缺点是载体的活化或固定化操作比较复杂,反应条件也比较强烈，所以往往需要严格控制条件才能获得活力较高的固定化酶。交联法依靠双功

5、能团试剂使酶分子之间发生交联凝集成网状结构，使之不溶于水从而形成固定化酚。常采用的双功能团试剂有戊二醛、顺丁烯二酸酊等。酚蛋白的游离氨基、酚基、咪II坐基及蔬基均可参与交联反应。交联法是用多功能试剂进行酶蛋白之间的交联，使酶分子和多功能试剂Z间形成共价键，得到三向的交联网架结构，除了酶分子ZI'可发生交联外，还存在着一定的分子内交联。多功能试剂制备固定化酶方法可分为：（1）单独与酶作用；（2）酶吸附在载体表面上再经受交联；（3）多功能团试剂与载休反应得到有功能团的载体，再连接酶。交联剂的种类很多，瑕帘用的是戊二醛，其他的述有并

6、氧酸衍生物、双偶氮二联苯胺、N,N-乙烯马来酰亚胺等。交联法的优点是酶与载体结合牢固，稳定性较高；缺点是有的方法周定化操作较复杂,进行化学修饰时易造成酶失活。各类固定化方法的特点比较:比较项目吸附法结合法交联法包埋法物理化学方法分类物理吸附化学共价键结合物理离子键结合化学键连接物理包埋制备难易易难易较难较难固定化程度弱强中等强强活力回收率较高低高中等高载体再生可能不可能可能不可能不可能费用低高低中等低底物专一性不变可变不变可变不变适用性酶源多较广广泛较广小分子底物、药用酶2、淀粉酶催化反应：淀粉酶：淀粉酶是指一类能催化分解淀粉

7、（包括糖原、糊精等）的糖莒键的酶之总称。淀粉酶包括：。一淀粉酶、B—淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、脱支酶、麦芽寡糖生成酶等水解酶类和窗萄糖甘转移酚、环状糊精葡萄糖廿转移酚等。a—淀粉酶是一种内切酶，它随机地从分子内部切开a—1.4糖苛键（水解中间的a-1.4键比分子末端的a-1.4键概率大），遇到分支点的a-1.6键不能切，但能跨越分支点而切开内部的a-1.4糖甘键，山于产物的还原性末端葡萄糖残基上的C1碳原子呈a—构型（光学），故称这种酶为Q—淀粉酶。a—淀粉酶的水解反应:淀粉在a—淀粉酶的作用下很快被切割成分子较小的糊精、低聚糖、

8、麦芽糖、葡萄糖等，引起粘度下降，对碘呈色反应为篮一紫一红一无色，又叫液化酶。a—淀粉酶的水解产物：水解有链淀粉，首先将淀粉降解为寡糖、麦芽三糖和麦芽糖，然后将寡糖、麦芽三糖进一步降解为麦芽糖和葡萄糖：水解支链淀粉，宙于不能水解a-1.6糖背键，产物除麦芽糖、少量葡萄糖外，述有