《荧光分析法》PPT课件.ppt

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1、荧光分析法（fluorescence)荧光棒发光原理荧光棒中的化学物质主要由三种物质组成：过氧化物、酯类化合物和荧光染料。简单地说，荧光棒发光的原理就是过氧化物和酯类化合物发生反应，将反应后的能量传递给荧光染料，再由染料发出荧光。目前市场上常见的荧光棒中通常放置了一个玻璃管夹层，夹层内外隔离了过氧化物和酯类化合物，经过揉搓，两种化合物反应使得荧光染料发光。荧光分析法荧光：物质分子接受光子能量被激发后，从第一激发单重态的最低振动能级返回基态时发射出的光。优点：灵敏度高；选择性好；试样量少；方法简单。缺点：应用范围小。荧光分析法：根据物质的荧光谱线位

2、置及其强度进行物质鉴定和含量测定的方法。第一节荧光分析法的基本原理一、分子荧光（一）分子荧光的产生基态单重态S三重态TE单重态：s=0，M=1，分子所处的电子能态。分子的多重性：总自旋量子数：三重态：s=1，M=3，分子所处的电子能态。1.分子的电子能级与激发过程电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量。2.荧光的产生传递途径辐射跃迁荧光振动弛豫无辐射跃迁磷光系间跨越内转换外转换S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量l2l1l3外转换l2T2内转换振动弛豫非辐射能量传递过程振

3、动弛豫(vibrationalrelexation)：出于激发态各振动能级的分子通过与溶剂分子的碰撞而将部分振动能量传递给溶剂分子，其电子返回到同一电子能级的最低振动能级间的过程；发生振动弛豫的时间10-12s。内部能量转换(internalconversion)：当两个电子激发态之间的能量相差较小以致其振动能级有重叠时，受激分子常由高电子能级以无辐射方式转移至低电子能级的过程。S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量l2l1l3外转换l2T2内转换振动弛豫外部能量转换（externalconversion)：激发态分子与

4、溶剂或其他分子之间产生相互作用而失去能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。体系间跨越(intersystemcrossing)：处于激发态分子的电子发生自旋反转而使分子的多重性发生变化的过程；分子由激发单重态跨越到激发三重态。非辐射能量传递过程S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量l2l1l3外转换l2T2内转换振动弛豫辐射能量传递过程荧光发射：激发分子从第一激发单重态的最低振动能级跃迁到基态各振动能级时所产生的光子辐射称为荧光；荧光辐射能要比激发能量低，荧光波长大于激发波长；荧光发射时间为10-9-10-

5、7s。磷光发射：激发分子由第一激发三重态的最低振动能级跃迁到基态各振动能级时所产生的光子辐射称为磷光；磷光辐射能要比荧光辐射能量低，磷光波长大于荧光波长；磷光发射时间为10-4-10s。S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量l2l1l3外转换l2T2内转换振动弛豫荧光分光光度计的主要部件：光源、激发单色器、发射单色器、样品池、检测系统。光源激发单色器样品池发射单色器检测器放大器指示器·记录器SK-2003A型荧光光谱仪(国内首创）RF-5400荧光光度计Hitachi(日立)F-2500荧光分光光度荧光分光光度计澳大利亚

6、（二）荧光的激发光谱和发射光谱激发光谱（excitationspectrum）：将激发光的光源用激发单色器分光，使不同波长的入射光激发荧光体，然后让所产生的荧光通过固定波长的发射单色器而照到检测器上，测定不同波长光照射下荧光强度的变化，以激发波长为横坐标，荧光强度为纵坐标，可得荧光物质的激发光谱。注意：激发光谱与其吸收光谱极为相似，但激发光谱曲线是荧光强度与波长的关系曲线，吸收曲线则是吸光度与波长的关系曲线，两者性质是不同的。荧光光谱（fluorecencespectrum）：固定激发光波长为最大激发波长，而让荧光物质发射的荧光通过发射单色器分光

7、扫描并检测不同波长下的荧光强度，以发射波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，得到物质的荧光光谱。荧光物质的最大激发波长（ex）和最大发射波长（em）是鉴定物质的根据；也是定量测定最为灵敏的条件。荧光光谱的普遍特性1.斯托克斯位移(Stokesshift):激发光谱与发射光谱之间的波长差值；荧光发射波长总是大于激发光谱波长。室温下菲的乙醇溶液荧光光谱2.荧光光谱的形状与激发波长无关电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，从而荧光发射光谱只有一个发射带，而且荧光光谱的形状与激

8、发波长无关。3.荧光光谱与激发光谱的镜像关系荧光光谱的普遍特性激发光谱与荧光光谱成对称镜像关系。nm200280360440520020