基于反相有机整体柱的新型蛋白质酶反应器.pdf

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1、第41卷分析化学(FENXIHUAXUE)特约来稿第1期2013年1月ChineseJournalofAnalyticalChemistry10～14DOI：10．3724／SP．J．1096．2013．20720基于反相有机整体柱的新型蛋白质酶反应器刘静2王方军张振宾2邹汉法(中国科学院大连化学物理研究所，中国科学院分离分析化学重点实验室，大连116023)(中国科学院研究生院，北京100049)摘要以牛血清白蛋白(BSA)为标准样品，以鉴定的独立肽段数目、蛋白质鉴定覆盖率和漏切率为考察指标，通过考察酶解缓冲液、反相柱基质的多孔结构、酶解反

2、应时问和整体柱的疏水性对反相蛋白质酶反应器酶解效率的影响，构建了一个基于反相有机整体柱的新型酶反应器，此反应器具有制备简单、通透性好、酶解时间短和蛋白质鉴定覆盖率高等特点。关键词反相有机整体柱；蛋白质酶反应器；液相色谱一质谱联用1引言随着电喷雾(ESI)和基质辅助激光解析(MALDI)等软电离技术的出现及相关质谱技术的发展，生物质谱已成为现代蛋白质组学研究的核心技术。基于质谱技术的蛋白质组学研究策略一般分为两种：一种是自上而下Top．down策略，一种是自下而上Bottom—up策略。由于现阶段质谱检测分子量范围和蛋白质分子低溶解度、低离子化

3、效率的限制，Bottom-up分析策略应用更为广泛。Bottom—up策略基于对酶解肽段的鉴定实现对蛋白质的鉴定，因此蛋白质的酶解是该分析策略的关键步骤之一。常规溶液酶解耗时长、操作繁琐、分析通量低，且后续的除盐步骤会造成严重的样品损失，不适于微量复杂蛋白质样品的分析。蛋白质酶反应器是用于蛋白质样品预处理及酶解的微流器件，主要分为固定化酶反应器和吸附型酶反应器两种。前者将蛋白酶固载在固相基质上，蛋白质在通过固相基质的过程中完成酶解；后者将蛋白质样品和蛋白酶通过离子交换等作用吸附在固相基质上面，通过调节pH值活化蛋白质酶进行酶解。蛋白质酶反应器

4、可实现蛋白质除盐纯化、修饰蛋白质富集等样品预处理与蛋白质酶解的集成，减少分析过程中的蛋白质样品损失，从而提高分析通量和检测灵敏度。整体柱因其制备简单、通透性好、传质速度快等优点，在蛋白质酶反应器中被广泛应用。甲基丙烯酸缩水甘油酯一二甲基丙烯酸乙二酯(GMA．EDMA)有机聚合物整体柱和有机-无机杂化整体柱材料都被用作蛋白酶的固载基质，实现了蛋白质样品的快速、高效酶解『81。但是固定化酶反应器的酶固载反应耗时长、操作繁琐且固定化过程易影响酶活性。吸附型酶反应器无需酶固载步骤，操作简单，更容易实现多次重复使用。Tian等[1伽发展了磺酸基强阳离子

5、交换整体柱吸附型胰蛋白酶反应器，对干细胞样品进行了大规模、高灵敏度和高准确度的定量蛋白质组分析。现有的吸附型酶反应器一般基于强阳离子和强阴离子交换色谱基质，尚无基于反相色谱基质的吸附型酶反应器的研究报道。这主要是由于反相色谱基质对蛋白质和蛋白酶的吸附作用较强，无法通过调节pH值使蛋白质样品和酶游离并充分接触，从而限制了酶解效率地提高。Russell等Ⅵ报道了胰蛋白酶等多种蛋白酶在80％乙腈中具有更高的酶解效率，可以显著缩短酶解时间并提高蛋白质鉴定的覆盖率。本研究制备了基于反相有机整体柱的吸附型蛋白质酶反应器，在完成蛋白质样品和酶吸附后通过高浓

6、度乙腈实现样品和酶的游离，从而提高酶解效率。本研究将反相整体柱应用于吸附型蛋白质酶反应器的制备，制备的新型蛋白质酶反应器既具备了整体柱通透性好、传质速度快的优点，又具备高有机相中酶解速度快、蛋白质鉴定覆盖率高的优势，在蛋白质组分析中具有良好的应用前景。2012-07—10收稿；2012—10—12接受本文系中国科学院科研装备研制项目(No．P020090520)和国家自然科学基金创新群体项目(No．21021004)资助E—mail：hanfazou@diep．ac．cn；wangtj@dicp．ac．cn第1期刘静等：基于反相有机整体柱的新

7、型蛋白质酶反应器2实验部分2．1仪器与试剂LTQ线性离子阱质谱仪(美国Thermo公司)，配有纳升电喷雾离子源和一个六通阀；SurveyorHPLC液相色谱系统(美国Thermo公司)，配有脱气机和四元液相泵。流动相A为0．1％甲酸溶液；流动相B为0．1％甲酸-乙腈溶液。十二烷基甲基丙烯酸酯(LMA)、二甲基丙烯酸乙二酯(EDMA)、一甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(—MAPS)、1，4一丁二醇、二硫苏糖醇(DTT)、碘代乙酰胺(I从)和TPCK处理的胰蛋白酶(美国Sigma公司)；偶氮二异丁腈(AIBN，上海第四试剂厂)；甲酸和牛血清白蛋白

8、(BSA，瑞土Fluka公司)；乙腈(色谱纯，德国Merck公司)；甲醇(色谱纯，山东禹王实业有限公司)；正丙醇(分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司)；二次去离子水