认识色谱柱—反相色谱柱.ppt

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1、色谱分离基本原理“两相分配，相似相溶”色谱柱结构色谱柱有方向性，主要与装填技术有关。筛板的内部孔形态会影响柱效规格内径长度粒径碳载量孔径比表面积材质封端表观规格：柱管材质，填料分类，尺寸，粒径隐藏信息：碳载量，平均孔径，比表面积，封端，键合类型，pH范围，最大耐压，筛板孔径等WatersXBridgeShieldRP184.6*250mm5um柱效拖尾载样量（体积）载样量（浓度）分离度回收率你能正确连接它们吗？填料硅胶等载体（正相色谱）硅胶+键合相（反相色谱）聚合物+键合相（离子交换，手性色谱柱等）

2、整体柱（空间排阻色谱等）反相色谱C18填料硅胶注意：硅胶颗粒大小分布金属残留内部孔径实心核颗粒四乙氧基硅烷(TEOS)硅甲基嵌入型聚乙氧基硅烷(MPEOS)甲基三乙氧基硅烷(MTEOS)改性硅胶硅胶快速溶解严重的柱失效柱寿命短暂因嵌入硅甲基的阻挡,颗粒表面溶解速度明显减缓柱寿命大大延长pH范围可达1~11普通硅胶柱waters改性硅胶柱碱性条件下硅胶溶解单、双、三官能团键合三官能团键合二官能团键合单官能团键合键合碳载量影响残留硅羟基比率键合相流失率键合密度常见键合相主要作用机理疏水疏水π-π疏水疏水

3、氢键π-π氢键氢键阳离子交换阴离子交换空间位阻：异丙基硅氧烷，异丁基硅氧烷增加pH范围，但有限，一般1~9空间位阻AgilentPhenomenex空间位阻抗水解AgilentXDB极性嵌入Waters“Shield”内嵌极性基团固定相：水表面层可能机理水“屏蔽”层改善与水的浸润性－100%水溶液兼容降低了碱性化合物的保留降低了拖尾现象屏蔽了带负电的硅羟基极性基团增加了表面层水的浓度与键合相的疏水性作用双重保留机理:1).与键合相的的疏水性作用;2).与残余硅醇基间的离子交换作用O-SiO-SiO-

4、O-SiO-SiO-O-SiO-O-SiO-SiO-SiO-O--SiO-SiO-SiO-SiOHO-SiO-SiOHO-SiOHO-SiO-SiO-SiOHO-SiO-Si(CH3)2HN+(CH3)2HN+当流动相pH值小于3时,硅醇基呈中性(未解离)BaseBase对碱性化合物的保留及严重拖尾两实验使用相同的传统C8硅胶柱离子交换作用碱性分析物在硅胶柱上的拖尾机理当流动相为pH6-8时,硅醇基带负电性(大部解离)既然pH<3时硅醇基离解受抑制，为何不在所有情况下采用酸性条件进行分离?低pH可导

5、致分离选择性的丧失!---碱性基团离子化，极性增加pH7.0pH2.0amitriptylinenortriptyline常用封尾end-capped：三甲基硅氧烷极性封尾，增加极性保留由于空间位阻的存在，键合反应最多只能覆盖50%的硅羟基，超过一半硅羟基是活性硅羟基，与碱性基团会发生离子交换作用，增加了保留，导致峰形拖尾，用短链氯硅烷（如三甲基氯硅烷）键合活性的硅羟基，可以减小这种影响，这种操作被称为封尾，封端，封口。封端封端–封口残余硅羟基–减少不可逆吸附或拖尾–增加碳含量（0.1%-1%）封端

6、现代色谱柱三大技术平台亲水AQ柱ECOSILODS-AQAtlantisDc18,T3SynergiHydro-RPHILIC柱Zic-HILICHypersilGOLDHILICAtlantisHILIC柱目的：提高极性化合物保留宽pH色谱柱ECOSILODS-ExtendXbridge/XterraC18/C8GeminiC18ZorbaxExtend目的：提高色谱柱pH使用范围纯硅胶柱ECOSILODS-SHPurospherSTARRP18eSymmetryC18极性嵌入柱ECOSILODS

7、-EPSZorbax-BonusRP18SymmetryshieldRP18目的：改善峰形未湿润的孔湿润的孔注意：保留时间与填料表面积与配体有关。然而，如果硅胶表面未湿润，那么有效的色谱表面积会减少95%，因此，减少被分析物的保留时间即等于“疏水塌陷”，记住：几乎所有的表面积都在孔内！低比例有机溶剂或纯水溶液流动相C18硅胶什么是“疏水塌陷”？疏水塌陷分0246810流动相：0.1%醋酸水溶液阿莫西林Vo：被分析物没有保留“湿润时”“去湿后”疏水塌陷此时色谱柱并没有“坏”，如何复原：低比例有机相低流

8、速冲洗过渡，然后高比例低流速。停流速后(孔去湿:~3%)流动相：0.1%醋酸水溶液Minutes0246810初始时保留时间无变化阿莫西林极性嵌入色谱柱：无疏水塌陷现象发生内嵌极性基团键合相：使用高比例水溶液流动相时色谱性能稳定疏水塌陷极性保留机理：离子交换+疏水作用1、极性封尾2、极性嵌入3、低碳载量4、保留硅羟基5、增加极性嵌入键合相AQ柱对极性与非极性化合物的优异保留特性在100％水溶液流动相中运行保持色谱性能稳定峰形优异超低键合相流失，质谱兼容酸性条件下稳定性