光谱法研究鸡蛋溶菌酶热变性与免疫原性的关系.pdf

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1、第39卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第2期2011年2月ChineseJournalofAnalyticalChemistry198～202光谱法研究鸡蛋溶菌酶热变性与免疫原性的关系吴序栎朱倩倩成小娟吴晖徐宏刘志刚(华南理T大学轻工与食品学院，广州510642)(深圳大学过敏反应与免疫学研究所，深圳518060)(深圳大学化学与化丁学院．深圳518060)摘要利用圆二色性光谱和荧光光谱对鸡蛋溶菌酶的热变性过程进行了系统的光谱学研究，得到了鸡蛋溶菌酶热变性过程的光谱学特征；通过酶联免疫吸附实验测定鸡蛋溶菌酶热变性过程的免疫原性变化；结合生物信息学方法，分析了热变

2、性过程中鸡蛋溶菌酶蛋白结构改变与其免疫原性变化之间的关系，建立研究食品过敏原蛋白热变性的光谱学方法。关键词鸡蛋溶菌酶；免疫原性；热变性；光谱学；生物信息学l引言鸡蛋是FAO和WHO认定的导致人类食物过敏的八大类食品之一”】，也是美国及欧盟新食品标签法中规定必须标示的过敏原成分之一口1。据国外流行病学统计，在食物过敏儿童中，大约35％的儿童对鸡蛋过敏，其中1岁前的幼儿更为常见，达到了54％，且患者多为未成年人0]。鸡蛋中的过敏原主要存在于蛋清中。蛋清中含有24种不同的蛋白质和一些次要蛋白质。目前发现蛋清中含有4种蛋白成分能与人类血清结合而引起过敏反应，公认为鸡蛋的主要过敏原，

3、它们分别是卵类粘蛋白(Gald1)、卵白蛋白(Gald1)、卵转铁蛋白(Gald3)和溶菌酶(Gald4)【4】。其中溶菌酶约占蛋清总蛋白的3．5％，化学性质非常稳定，是最后被报道的蛋清中的主要过敏原11，对其热变性与免疫原性关系的研究还未见报道。光谱学方法是研究蛋白质高级结构的有力手段。本研究以鸡蛋溶菌酶为研究对象，利用原二色性光谱(Circulardichroism，CD)、荧光光谱和生物信息方法研究热变性过程中鸡蛋溶菌酶蛋白构象的变化及其特点，结合酶联免疫口发附(Enzyme-linkedimmunosorbnentassay，ELISA)实验，探讨鸡蛋溶菌酶热变性过

4、程中结构改变与其免疫原性之间的内在关系，建立了对食品过敏原蛋白的结构与其免疫原性构效关系进行研究的光谱学分析方法，对研究热变性改变食物过敏原免疫原性的机理进行了有益的探索。2实验部分2．1仪器与材料j-815型的圆二色光谱仪(Jasco公司)；F一4500型荧光分光光度计(日立公司)；紫外MK3酶标仪(Thermoelectron公司)。牛血清白蛋白(BSA)、鸡蛋溶菌酶(Sigma公司)；HRP标记的链霉亲和素(Vector公司)；生物素标记羊抗人IgE抗体(KPL公司)：鸡蛋过敏病人阳性血清由深圳市儿童医院提供(经UnitCAP检测，2级以上)。2．2实验方法2．2．1

5、蛋白质结构及抗原表位分析鸡蛋溶菌酶的晶体结构已经被解析，在PDB数据库中的编号为3A8Z，通过生物信息学方法用UCSF—Chimera软件计算出鸡蛋溶菌酶的结构数据及各种发光基团的发布，利用DNAStar软件对抗原表位相关的参数进行比较，根据其亲水性、表面可及性、抗原指数和二级结构信息对其主要抗原表位进行预测]。2．2．2鸡蛋溶菌酶的热变性用1mol／LPBS缓冲液(pH7．0)溶解鸡蛋溶菌酶，分别在20，70，80，9O，2010-0608收稿；2010-09-01接受本文系国家自然科学基金(Nos．30871752，30570421)资助项目E—mail：lzg@SZt

6、1．educn第2期吴序栎等：光谱法研究鸡蛋溶菌酶热变性与免疫原性的关系199100，l10和120。C条件下恒温10min。2．2．3鸡蛋溶菌酶的糖基化用lmol／LPBS缓冲液(pH7．0)溶解鸡蛋溶菌酶，加入1：1(w／w)的葡萄糖，以不加葡萄糖的鸡蛋溶菌酶为对照，于100。C恒温10rain。2．2．4CD光谱实验取适量用不同方法处理的鸡蛋样品，用1mol／LPBS缓冲液(pH7．0)稀释为0．25g／L溶液，测定其远紫外区(190～250nm)的CD光谱。每份样品重复3次，累加得到CD谱图；图谱经过仪器本底消除和溶液空白差减，然后利用CONTIN软件分析谱图数据，

7、计算出重组蛋白各种二级结构的百分比含量。2．2．5荧光光谱实验取经不同温度处理的样品和糖基化产物，用1mol／LPBS缓冲液(pH7．0)稀释为0．05mg／L溶液，进行荧光光谱测定。分别以280和295rim的激发光激发，记录样品在300～550nm之间的发射光谱。2．2．6ELISA实验参照文献[9】进行。3结果与讨论3．1鸡蛋溶茵酶的结构及抗原表位根据已报道的溶菌酶蛋白的晶体结构数据得其三级结构信息(结构图未给出)，通过生物信息学方法得到鸡蛋溶菌酶的二级结构和抗原表位信息(图1)。由结果可知，鸡蛋溶菌酶中7个