应用胚胎干细胞试验对多菌灵胚胎毒性的初步评价.pdf

《应用胚胎干细胞试验对多菌灵胚胎毒性的初步评价.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、·128·毒理学杂志2014年4月第28卷第2期JToxicolApril2014Vo1．28No．2中图分类号：R114文献标识码：A文章编号：1002—3127(2014)02—0128一O4·实验研究·应用胚胎干细胞试验对多茵灵胚胎毒性的初步评价周韧，程薇，冯艳，王艳(1．上海交通大学医学院公共卫生学院，上海200025；2．上海交通大学医学院附属新华医院环境与儿童健康教育部重点实验室)【摘要】目的应用胚胎干细胞(ESC)和胚胎干细胞试验(EST)，初步评价多菌灵的胚胎毒性，并探讨可能的毒性机制。方法应用AlarmaBlue法检测多菌灵对ESC和3T3成纤维细胞活性的影响；未分化的ES

2、C体外经悬滴、悬浮培养后用10mol／L抗坏血酸诱导分化为具搏动能力的心肌细胞，暴露于不同浓度的多菌灵(0、1、2．5、5、1O和20nmol／L)，在分化终点即第1O天时获取分化细胞的RNA，并检测细胞多能性基因OcM和心肌特异性基因Ot—MHC的相对表达量，计算多菌灵对ESC分化的半数抑制剂量。根据EST的评价标准，对多菌灵的胚胎毒性进行评价。结果多菌灵对3T3细胞和ESC细胞的存活率随着多菌灵浓度的增加而显著降低，ESC对多菌灵毒性更敏感；1nmol／L多菌灵使Oct4的表达量显著升高，而2．5、5、10和20nm~l／L多菌灵使Oct4的表达量显著降低；随着多菌灵浓度的增加，—MHC

3、基因表达量逐渐降低，呈剂量一效应关系。多菌灵经EST评价为强胚胎毒性化合物。结论多菌灵具强胚胎毒性，其对ESC细胞活性及多能性基因影响显著可能是其作用的机制之一。【关键词】胚胎干细胞试验；胚胎毒性；多菌灵多菌灵(Carbendazim)是一种高效、广谱的苯并咪毒性等级进行初步评价，并提示在多菌灵的暴露敏感唑类杀菌剂，是苯菌灵在环境中的降解产物及在动物期的毒性作用机制。和人体中的代谢产物。多菌灵的大鼠急性经口半数致死量大于15000mg／kg，经皮半数致死量大于l材料与方法2000mg／kg。按照我国农药毒性分级标准，多菌灵属1．1细胞小鼠胚胎干细胞D3细胞系(ESCD3)和于低毒杀菌剂。目前

4、，在多菌灵的相关毒性研究Balb／c品系小鼠3T3细胞均购自中国科学院上海生中，其生殖毒性资料较充分，而胚胎毒性的资料却较命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所。少。雌鼠在孕期第6～15天暴露于35mg／kg剂量1．2实验试剂多菌灵(纯度99％)、二甲亚砜多菌灵，即可观察到吸收胎增多，活胎数减少，胎儿发(DMSO)、丝裂霉素c、抗坏血酸：美国Sigma公司；育迟缓及胎儿畸形等现象。而非洲爪蟾胚胎暴露KnockOutDMEM培养基、0．25％胰蛋白酶／EDTA、特于较低剂量(4~mol／L)的多菌灵，即出现胚胎畸形或级胎牛血清、L一谷氨酰胺、B．巯基乙醇、非必需氨基酸、胚胎死亡。这些研究提示多

5、菌灵在低剂量即具有Trizol试剂、AlamarBlue试剂：美国Life公司；白细胞胚胎毒性。Jeffery等在仓鼠怀孕周期中观察到，雌抑制因子：美国Millipore公司；逆转录反应试剂盒、实性仓鼠接触多菌灵后，胚胎从8细胞期开始便难以进时定量rea1．timePCRSYBRGreen试剂盒：大连宝生物行后续的发育，提示着床前期／着床期是多菌灵胚胎毒工程有限公司。其余试剂均为国产分析纯。性的暴露敏感期，但具体机制尚不明确。1．3实验仪器倒置显微镜(日本Olympus公司)，胚胎干细胞试验(embryonicstemcelltest，EST)是低温高速离心机(美国Thermo公司)，ABI

6、7900HT定一种无需牺牲动物的体外评价胚胎毒性的替代方法，量PCR仪(美国ABI公司)，多功能酶标仪(美国利用胚胎干细胞可诱导定向分化的能力，模拟胚胎早Thermo公司)，NanoDrop紫外分光光度计(美国期发育过程，进而观察到化合物暴露对胚胎发育的影Thermo公司)。响及可能机制。因此，利用该模型，可对多菌灵的胚胎1．4ESC的培养取出一180oC液氮冷冻保存的ESCD3细胞进行复苏，接种于丝裂霉素c处理后的小基金项目：上海市科技发展基金实验动物专项(12140901000)鼠胚胎成纤维细胞滋养层上，加入含15％特级胎牛血作者简介：周韧，本科，研究方向：健康风险评价。清、B一巯基乙醇

7、0．1mmol／L、L一谷氨酰胺2mmol／L、通讯作者：王艳，博士，博士生导师，研究方向：环境污染对健康影响及1％非必须氨基酸和1×10U／L白血病抑制因子的其污染控制技术。毒理学杂志2014年4月第28卷第2期JToxicolApril2014Vo1．28No．2KnockOutDMEM培养基进行培养以保持ESC的未分反向：5’-TGCCCCCATGTTTGTGATG一3’，正向：5’．化状态。进行细胞毒