人外周血单核细胞分离技术.doc

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1、人外周血单核细胞分离1. 抗凝血的预离心分别取正常人新鲜抗凝全血A: 20mL于50mL离心管中，以2000r/min离心20min，吸弃上层血浆，获得下层沉淀细胞约10～12.5mL。2. 沉淀细胞的稀释与离心分离在所获取沉淀A中的细胞中加入Hank′s液(不含Ca2+、Mg2+,pH7.2～7.6) 体积比仍未1:1，混匀，制成细胞悬液。B: 无菌抗凝血与Hank′s液或PBS以1:1体积在试管中混匀。另取一离心管，加入LTS1077淋巴细胞分层液，然后用毛细吸管距分层液上1cm处将细胞悬液小心而缓慢地加于其上面，使稀释血液重叠于分层

2、液上。此时稀释后的细胞悬液分离液淋巴细胞体积为：1:1。与用水平离心机以2000r/min离心20min，离心结束后，取出离心管，可见管中液体已经分层。管内可见分为4层：最上层是血浆，含部分血小板：第二层为薄薄的白膜层，主要台单个核细胞，还混杂有少量血小板；第三层为分离液层；第四层为粒细胞及红细胞，红细胞沉于管底，而粒细胞则紧贴在压积红细胞上呈一层很薄的白膜3.  单个核细胞的提取、洗涤与悬浮、贴壁吸去最上层的血浆，收集血浆层和淋巴细胞分离液交界面的单个核细胞，尽量全部吸出PBMC。加3~4倍以上体积Hanks或PBS液于所得的单个核细胞

3、中，用毛细吸管轻轻吹判均匀，避免产小气泡，液柱高度不超过离心管的2／3。混匀后离心1500r/min离心10min，低速离心有利于去除细胞悬液中留存的血小板，去上清液。注意：还可以先用吸管把雾状层上面的液体吸走，注意不要碰到雾状层，然后在把要的部分慢慢吸出来。第二种方法，比较简单一些。再用同样洗涤液洗涤细胞2次，1500r/min离心10min，洗去残留的淋巴细胞分离液。再以RPMI-1640培养基离心洗涤1次，吸尽上清，以充分去除血小板等杂质。按每毫升血液标本加0.2mL含20%小牛血清的Hank′s液(或含10%胎牛血清及25mmol

4、/Lhepas的RPMI-1640液3～4mL)重新混悬细胞37℃、5%CO2孵育箱中培养2～3h后去除上清，得到贴壁的单核细胞。于各培瓶中分别加入含10%胎牛血清的RPMI-1640液3～4mL，按需调定细胞密度,于37℃、5%CO2孵育箱中培养备用。4. 单核细胞的纯度与细胞活力的鉴定取一定体积的细胞悬液送做流式细胞CD14、CD56等检查,以测定所得细胞的纯度。取1滴细胞悬液置于血细胞计数板内计数。以台盼蓝拒染法检测细胞活力。取1滴细胞悬液加1滴2%台盼蓝染液混匀，加盖片，显微镜高倍镜检，活细胞不着色，折光强；死细胞被染成蓝色，体积

5、略膨大。