人体外周血单核细胞的分离与鉴定

《人体外周血单核细胞的分离与鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、人休外周血单核细胞的分离与鉴定上海市尢疫学研究所基越丸疫研究宣张一平陆佩华徐丈玉樊绮诗涂苍宁・或人杰附图Pet811分高细购示意图单核细胞在免疫反应中的作用已日益受到重视，但目前对人体单核细胞的研究，除应用斑酸BT发鞄技术外（叫大多数实验室采用平皿粘附技术从外周血获得单核细胞我们卷照Gmelig-Meyling报道的用Percoll分淘人体外周血单核细胞的方法⑹，根据本实验室条件加以修改，并对分离所得各组分细胞进行T、B、单核细胞百分比的鉴定，及其对杭物血凝素（PHA）的反应性的测定.材料与方法一、单核细胞的分离采用

2、Pcrcoll连续僭度梯度分离法⑹。方法如下:先用淋巴细胞分离液（F/H液，比重1・077,上海试剂二厂出品）分离出外周血单个核的细胞⑷，该细胞组分以F表示。除留一定数量细胞作对照鉴定外，其余细胞以无血淸RPMI1640液1奄升悬浮之，浓度为20〜35x细胞/亲升.取10・5Percoll原液（瑞典Pharmacia岀品，209条件下测得其比垂为1.030）,加双离子强度确酸缓冲蔽（0.30MNaCl,0.02DM确酸缓冲液.pH7・4）9毫升。充分混匀后，平均分至两只半透明软須料管（宜径1.2H米，高9厘米）中，

3、置高速离心机（英国MSE出品，角式转头，45P偏角，4©14.000〜15,000转/分离心40分钟，以形成连续密度梯度。将上述高浓度F组分1砥升轻轻铺于Pcrcoll液面上.于水平式离心机（北京医疗仪器厂出品，LXJ^）2,000转/分离心20分钟。经如此处理后,一般可分得4个细胞组分（附图）。用吸管吸取组分a,得到富含单核细胞的群休（M）'吸取组分皿，得到缺乏单核细胞的小淋巴细胞群体（P）。将所得M与P组分细胞分别用Hanks液洗涤两次后计数，并进行各种形态与功能鉴定。二.活力鉴定以常规锥蓝排斥试验鉴定细胞活力，

4、结果以存活细胞百分比农示•三、形态鉴定（一）瑞氏染色常规制片后行瑞氏染色，于油犍下读片，计数单核细胞百分比。（二）乳胶吞噬试验除所用乳胶颗粒直径约为0・04微米外（上海市医学化验所岀品），其余大致与Pichler等使用的方法相同⑸。结果以吞噬阳性细胞百分比表示。（三）非待异性酯酶染色采用活性花环■酯酶双标记技术⑹，结采以酯酶柴色阳性细胞百分比表示。（四）细胞膜表面免疫球蛋白荧光抗体标记方法详见文献⑵，结果以膜表面荧光阳性细胞百分比表示。四.功能鉴定用体外PHA刺激试验⑹，结果以每组三个复管的平均每分钟脉冲&（cpm）

5、±标准差（SD）来表示。•进俺人员结果一、单核细胞的活力与得率经F/H液和Percoll液两次分离后，共得三个细胞组分，即组分F.P、Mo各组分细胞活力均大于95第。M组分细胞得率为10.5兔，P组分为62.1^（^1）,合计细胞回收率为72・6%。二、各细胞组分中T、B细胞比例的改变以非特异性酯酶染色阳性细胞作为T细胞，以细胞表面免疫球蛋白荧光标记阳性细胞作为B细胞，然后观察T、B细胞在F,P表1Percoll分离前后各细胞组分的需•力与得率细胞组分例数«e^ft（xio»）得半"）F，1127.3±6.7・P11

6、1&8±6.862.1>95M112.9±1.910.5*即供进一步分离“与P绸分细灼W用的绷胞妆（用均值±SD表示，下英同〉和M三个细胞组分中百分比的变化。Pcrcoll分离ffi!（F组分），T细胞占81.8外，分离话P组分T细胞占86.3輪，M组分占355%。F组分B细胞占13.5^,分离后P组分B细胞占8.2%,M组分占16.6%（友2）。表2各细胞组分T、B和皿核细胞中阳性细胞百分率〈％严纶屜组分酯陆染色（T细胸）染也（B细胞）瑞氏染色（的核细跑〉（吊桂细他）F81.8±3.813.5±4.716.2±5.

7、7164±4.1P86.3±5.18.2±5.05.8±4.23・7±1.BM35.5±19.116.6±11.078.4±4・264.9±11.2•经：则验.M组分单披细胞百分率阴昱岛于F与P组分（P

8、的比较组分瑶氏染色单核细狗（％）乱较外协Pifi甲假细胞（％）F716.2+5.7916.4±4,1>0.05P85・8±4.2103.7±L8>0.05M878・4±19.8864.9±1L2>0.05F，143.3±2.4713.7+3.8<0.001*为27~93匸放篮3小时仍进行霸定两种方法所鉴定的各组分单核细胞百分比的结果比较，及较高