新细胞操作技术.doc

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1、第一章一、体外培养就是从机体内在无菌条件下取出组织细胞，在体外模拟机体内的生理条件（即放置在无菌益皿内，给于适当的营养和其它一些包括pH、氧气、温度等条件）使其在体外能够继续生存和生长，从而在比较简单和方便的条件下来研究它的生长、分化、发育过程中的一些问题的一门技术。（一）体外培养包括的内容1、器官培养2、组织培养3、细胞培养（二）体外培养技术的应用领域1）在病毒学方面的应用2）在肿瘤研究方面的应用3）在辐射生物学方面的应用4）在临床医学方面的应用5）在药物筛选和检测方面的应用6）在现代生物技术中的应用（三）体外培养的突出

2、优点二、体内培养就是将活体组织、细胞、器官、其至活的个体从自体内或其寄生的体内取出，放在其它生物体内让其生长和发育的方法。第二章体外培养的历史一、早期培养1885年W.Roux体外移植（Explantation）二、体外培养的建立1907年RoosHarrisonHarrison工作的儿个标志1、标志着体外培养技术的创立2、标志着盖片悬滴法培养方法的建立3、标志着神经组织体外培养的开始4、标志着神经纤维是山神经细胞伸展出来的这一重大理论的诞生1910年CarrelCarrel的三个方面的贡献1、他把外科手术的无菌操作要领应

3、用于体外培养2、他发现鸡胚浸出液对多种细胞的生长有高度的促进作用3、创制了各种式样的培养瓶■即称为CarrelFlask卡氏瓶三、体外培养技术的发展1、营养条件方面的研究2、培养器皿方面的研究!1!、体外培养在我国的发展情况昆虫体外培养肿瘤细胞培养神经细胞培养器官培养方面微生物方面的培养（唐仲章1953,王潜渊1957,汤飞凡1958,郭辉玉I960）（高尚荫1956-1957,刘年翠1958）（潘琼赌1960,鄂征1962）（鲍璇1962,邱文钊1963,郭婉华1963）（陈瑞铭1954-1963）第三章培养用液一、天然

4、培养液1、生理盐溶液2、组织或胚胎抽提液3、血浆和血清1.1生理盐溶液要考虑的因素a>渗透压b、氢离子浓度c>缓冲系统<1、无机离子e、糖类f、水1.2生理盐溶液的主要功能常用作稀释液来维持细胞的渗透机能b、作为缓冲液维持培养液的酸碱度c、供给水分、无机离子以及细胞生长分化之能源2」组织或胚胎抽提液的来源成年动物的心脏、平滑肌、横纹肌、肺、肝、肾等多种组织胚胎的來源由鸡胚、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、羊、牛等2.2胚胎抽提液可分三部分a＞全浸出液b^大分了部分c、小分子部分3.1血浆的来源鸡、人、羊、牛等3.1.1鸡血浆的优点a

5、、血钙水平恒定b、纤维蛋白溶酶含量低，不易液化胶原胶原的来源大鼠尾鼠尾胶原的制备鼠尾胶原（coliegen）:常用的包被培养器皿的基质。制备方法较简单易行:主要实验材料一些解剖动物和盛装液体的器具以及配制的实验溶液。所要准备的器具组织剪2把，有齿银1把，无齿银1把，200ml烧杯1个，培养皿1个，带盖广口瓶1个,离心管、小瓶数个，滴管若干。以上物品须经严格高压消毒灭菌。需配制的液体0.1%酷酸溶液。经44.48N10min高压蒸汽灭菌（或是过滤除菌）后备用。此外还有用消毒双蒸水配制75%酒精溶液。取大鼠尾巴，洗净，置75%

6、酒精浸泡消毒后，手持尾巴，用止血钳夹住尾巴尖端，折断尾骨后拉出尾腱，将尾腱剪碎后置消毒的三角烧瓶中，称尾腱的重量，按每克尾腱50迅的比例加入0.1%醋酸溶液，摇晃，使尾腱分散于醋酸溶液中，4°C放置48小时，离心。吸取其上清，分装至小瓶，4°C保存。上述制备过程均在无菌条件下完成。详细步骤如下：1=75%酒精浸泡大鼠尾巴30min；2o将尾巴剪开、去掉皮毛，并剪成小段（3cni左右），抽出银色的尾鍵；30把剪碎的尾键置于150ml,0.1%消过毒的酷酸中，4°C放置，并不时振荡；4048h后取上清，4000转离心30min

7、后，取上清；5。分装上清（鼠尾胶）4度（或-20度）保存。有时可继续向4。中沉淀中加入10—20ml酯酸，重复以上步骤，以制备更多的鼠尾胶。在使用时,先将冰存的胶原液在室温下解冻，再按以下步骤包被培养器皿：1）用吸管吸取胶原液，在无菌的培养器皿的生长面内壁上均匀地涂上薄薄的一层胶原溶液。2）若包被的是培养瓶，可向培养瓶通入氨气或用浸有氨水的棉球封口片刻。让氨气充入瓶内后，即对旋紧瓶盖或塞紧瓶塞。若为培养皿或板的话，可将培养皿或板放在己消毒的饭盒内，将浸有氨水的棉球放入饭盒内，盖紧饭盒盖，四周用封口胶封死。3）待氨气与胶原作

8、用30min后，胶原凝固，然后用无菌生理盐水或Hanks液浸洗。4）置超净工作台内鼓风晾干。紫外线照射过夜。备用。所购买鼠尾胶原I型C7661（粉剂）的使用方法1.将胶原加入到O」N醋酸的中，制备成浓度为0.1%的溶液。在室温中搅拌1・3小时直到完全溶解。2.建议将溶液转移到拧口的玻璃瓶中，并小心的在瓶