DB22∕T 2972-2019 羊泰勒虫病病原检测 PCR法.pdf

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1、ICS11.220B41DB22吉林省地方标准本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2972—2019羊泰勒虫病病原检测PCR法PCRassayfordetectionoftheileriaovis本标准仅供内部使用不得翻印2019-05-27发布2019-06-17实施吉林省市场监督管理厅发布本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2972—2019本标准仅供内部使用不得翻印前言本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。本标准由吉林省畜牧业

2、管理局提出并归口。本标准起草单位：延边大学、吉林农业科技学院、吉林省动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人：贾立军、田万年、柴方红、梁晚枫、陈健、王海军、王欣睿、李国峰。本标准仅供内部使用不得翻印I本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2972—2019本标准仅供内部使用不得翻印羊泰勒虫病病原检测PCR法1范围本标准规定了羊泰勒虫病病原PCR检测方法原理、试剂和仪器、样品采集、操作步骤和判定结果。本标准适用于绵羊泰勒虫病病原检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的

3、。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理双链DNA在高温加热的作用下变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则，通过人工合成的特异性寡核苷酸引物与单链DNA模本标准仅供内部使用不得翻印板中的一段互补序列结合，形成部分双链，再利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸(dNTPs)合成新生的DNA互补链，进而完成特定片段的体外扩增。4试剂和仪器4.1试剂除特别说明以外

4、，本标准所用试剂均为分析纯，实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。4.1.1血液DNA提取试剂盒。4.1.210×PCR缓冲液。4.1.3dNTP（dATP、dCTP、dGTP、dTTP），浓度2.5mmol/L。4.1.4TaqDNA聚合酶，浓度5U/μL。4.1.550×TAE缓冲液见表A.1。4.1.610mg/mL溴化乙锭见表A.2。4.1.71%琼脂糖凝胶见表A.3。4.1.8加样缓冲液见表A.4。4.1.9阴性对照为健康绵羊血液DNA提取物。4.1.10阳性对照为羊泰勒虫感染的绵羊血液DN

5、A或含有目的片段DNA序列，DNA序列参见附录B。4.1.11空白对照为灭菌双蒸水。4.1.12DNAMarker分子量标准。4.2耗材4.2.1抗凝管。4.2.2吸头（200μL～1000μL、20μL～200μL、2μL～20μL、0.5μL～10μL）。1DB22/T2972—20194.2.3Eppendorf管（1.5mL、0.5mL、0.2mL）。4.2.4PCR反应管。4.2.5三角瓶。本标准仅供内部使用不得翻印4.3引物引物序列与浓度见表1。表1引物序列与浓度引物引物序列长度/bp基因序列浓

6、度/μmol/LP1（上游引物）5'-TGATGAGTTGATGTATTGTGGC-3'18SrRNA67110(AY262119)P2（下游引物）5'-TACCCGCATCCTATTTAGCAG-3'4.4仪器设备4.4.1微量加样器，单道2μL、10μL、20μL、100μL、200μL和1000μL。4.4.2低温高速离心机，12000r/min以上。4.4.3PCR扩增仪，温度范围为4℃～100℃。4.4.4分析天平，感量0.1mg。4.4.5高压灭菌器，120℃以上。4.4.6微波炉或恒温水浴锅，

7、室温～100℃。本标准仅供内部使用不得翻印4.4.7水平电泳槽。4.4.8电泳仪，电压1V～300V，电流1mA～400mA。4.4.9凝胶成像系统或紫外灯。5样品采集用抗凝管（4.2.1）无菌采集待检绵羊血液样品5mL，编号。冷藏条件下送实验室检测。6操作步骤6.1样品DNA制备按照血液DNA提取试剂盒（4.1.1）操作说明书，提取待检绵羊血液样品基因组DNA、阴性对照（4.1.9）样品基因组DNA和阳性对照（4.1.10）样品基因组DNA。6.2PCR检测在PCR反应管（4.2.4）中依次加入反应试剂，

8、PCR扩增体系为25µL，见表2。混匀后置PCR扩增仪（4.4.3）中，反应条件为96℃预变性5min，94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸1min，进行35个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存。同时设定阴性对照、阳性对照和空白对照。2DB22/T2972—2019表2PCR检测反应体系试剂本标准仅供内部使用不得翻印体积10×PCR缓冲液2.5µL2.5mmol/LdNTP2.0µL10µmol