DB22∕T 2629-2017 猪肠道微孢子虫检测 聚合酶链式反应(PCR)法.pdf

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1、ICS11.220B41备案号：56330-2017DB22吉林省地方标准本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2629—2017猪肠道微孢子虫检测聚合酶链式反应（PCR）法本标准仅供内部使用不得翻印Detectionmethodofpolymerasechainreaction(PCR)ofEnterocytozoonbieneusiinpigs2017–06-12发布2017-08-12实施吉林省质量技术监督局发布本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2629—2017本标准仅供内部使用不得翻印前言本标准按照GB/T1.1-20

2、09和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。本标准起草单位：吉林省畜牧兽医科学研究院。本标准主要起草人：曹利利、郭衍冰、姚新华、苑淑贤、程荣华、姚琳、董航、邵洪泽。本标准仅供内部使用不得翻印I本标准仅供内部使用不得翻印本标准仅供内部使用不得翻印DB22/T2629—2017本标准仅供内部使用不得翻印猪肠道微孢子虫检测聚合酶链式反应（PCR）法1范围本标准规定了猪肠道微孢子虫PCR检测方法的技术要求。本标准适用于猪肠道微孢子虫的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所

3、注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件本标准仅供内部使用不得翻印3.1猪肠道微孢子病Intestinalmicrosporidiosisofpig由肠道微孢子虫(Enterocytozoonbieneusi)引起的猪的一种以腹泻为主要特征的人兽共患病。4试剂、材料4.1试剂除另有规定，本标准所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682的双重蒸馏水（ddH2O）。4.1.1粪便DNA提取试

4、剂盒4.1.210mg/mL溴化乙锭（EB）溶液（见附录A.1）4.1.350×TAE电泳缓冲液（见附录A.2）4.1.41.5%琼脂糖凝胶（见附录A.3）4.1.5上样缓冲液（见附录A.4）4.1.610×PCR缓冲液（见附录A.5）4.1.7200U或2U/μLTaqDNA聚合酶4.1.810mMdNTPs4.1.9标准分子量DL2000Marker4.1.101.4g/mLCsCl溶液（见附录A.7）4.1.11猪肠道微孢子虫阳性对照：肠道微孢子虫基因组DNA（10ng/μL）。4.1.124条引物序列及浓度见表1。1DB22/T2629—2017表1

5、引物序列及浓度使用浓度引物引物序列本标准仅供内部使用不得翻印nmol/μLOUT-F5’-GATGGTCATAGGGATGAAGAGCTT-3’OUT-R5’-AATACAGGATCACTTGGATCCGT-3’10IN-F5’-AGGGATGAAGAGCTTCGGCTCTG-3’IN-R5’-AATATCCCTAATACAGGATCACT-3’4.2材料4.2.1离心管（15mL、50mL、1.5mL）4.2.2药品勺4.2.3称量纸4.2.40.2mL薄壁PCR管4.2.5500mL量筒4.2.6500mL锥形瓶4.2.7吸头（10μL、200μL、10

6、00μL）5仪器设备本标准仅供内部使用不得翻印5.1分析天平5.2PCR扩增仪5.3台式低温高速离心机5.4核酸电泳仪5.5紫外凝胶成像仪5.6可调移液器（2μL、20μL、200μL、1000μL）5.7恒温水浴锅6试验步骤6.1粪便样品处理采集腹泻猪新鲜粪便样品约30g，立即放入无菌处理的50mL离心管中，加入35mLddH2O混匀，漩涡震荡10min，过300目网筛；滤液转入50mL离心管中，补充ddH2O至45mL，室温1500×g离心10min，弃上清；沉淀用25mLddH2O重悬，加入25mLCsCl(1.4g/ml)溶液混匀，室温300×g离心

7、15min；吸取2mL表层液体转入15mL离心管中，加ddH2O至13mL，平衡后室温1500×g离心10min，弃上清；沉淀用100μLddH2O重悬，转入1.5mL离心管，4℃保存备用。6.2基因组DNA提取6.2.1样本DNA提取用粪便DNA提取试剂盒提取上述样本DNA，操作方法按说明书进行。6.2.2阳性样品DNA提取2DB22/T2629—2017用粪便DNA提取试剂盒提取猪肠道微孢子虫DNA，操作方法按说明书进行。6.2.3阴性对照DNA提取本标准仅供内部使用不得翻印健康猪粪便的DNA，获取方法同待检样品的处理方法。6.3空白对照以ddH2O为模

8、板，作空白对照。6.4PCR扩增6.4.1第一轮扩增