有机有机荧光染料在荧光免疫分析法中的应用.doc

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1、有机荧光染料在荧光免疫分析法中的应用摘要免疫分析是基于蛋白抗原和抗体之间、或者小分子半抗原和抗体之间的特异性反应的分析方法，是生物分析化学的重要内容之一。本文在阐述荧光免疫分析法的基本原理与特点的基础上，介绍了有机荧光染料在其中的一些应用。并对有机荧光染料在应用中的一些问题和发展方向进行了简要论述。关键词免疫分析；荧光染料；特异反应1前言免疫分析是基于蛋白抗原和抗体之间、或者小分子半抗原和抗体之间的特异性反应的分析方法，是生物分析化学的重要内容之一。由于免疫分析本身的特点，如涉及到生物活性物质以及组成复杂的样品

2、，常常要求有较高的灵敏度、选择性以及稳定性。从免疫分析采用的检测技术看，它大致可以分为以下五类：采用放射性活性检测的放射性免疫分析法（RIA）、采用吸光度检测的酶免疫分析法（EIA）、采用荧光检测的荧光免疫分析法（FIA）、采用化学发光检测的化学发光免疫分析法（CLIA）、采用电化学检测的电化学免疫分析法（ECIA）。RIA灵敏度高，适用于临床上一些超痕量物质的测定，但它本身存在着很大的缺陷，如放射性标记物半衰期短、易造成环境污染和人体伤害，一般只能进行固相免疫分析。因此逐步被非放射性免疫分析所取代。EIA是一

3、种有效的非放射性免疫分析方法，它以酶为标记物，结合酶的高效放大作用和显色检测的简便性，从而得到了广泛应用。但他也存在若干问题，如酶的稳定性差、对抑制和变性因素敏感以及光度测量灵敏度低等。CLIA法是化学发光与免疫测定结合起来的一种高效检测手段，灵敏度高，不需要激发光源，仪器简单，但是可以利用的化学发光反应相对有限。ECIA是近年发展起来的，仪器易小型化，适合于不透明样品。FIA作为一种非放射性免疫分析法，与EIA、CLIA相比，具有灵敏度高、可测参数多、动态范围宽、标记物稳定且可实现均相免疫分析等优点。时间分辨

4、荧光免疫分析法（TrFIA）的发展，极大提高了FIA的检测灵敏度。从目前的发展趋势看，FIA已成为一种成熟有效的非放射性免疫分析法，并得到广泛应用。同时FIA也是免疫分析研究中最为活跃的领域。标记物的选择对免疫分析的灵敏度和选择性至关重要，筛选性能优良、灵敏度高且易标记的标记物一直是免疫分析的研究课题。荧光免疫分析的标记物大致可分为三类：有机荧光染料、酶和无机金属配合物。2荧光免疫分析法的原理FIA存在两种模式，即竞争型和夹心型。2.1竞争型（抗原和标记抗原竞争抗体）竞争型的测定原理是基于未标记的抗原(Ag)和

5、标记的抗原(Ag-L)竞争结合有限的抗体(Ab)而实现的分析法。检测时，Ab和Ag-L的浓度是固定的。当未标记的Ag加到Ab和Ag-L的免疫混合物中后，Ag和Ab的结合使得Ag-L与Ab的免疫复合物的量减少。样品中存在的Ag越多，Ab结合的Ag-L便越少，从Ab-Ag-L免疫复合物的减少或游离Ag-L的增加可以定量测定出样品中待测抗原的含量。其反应过程如下式所示：示意图如下：2.2夹心型（Ag有限）对夹心型免疫分析来说，其反应原理是免疫反应的载体上固定过量的Ab，然后加入一定量的Ag，免疫反应后，再加入过量的标

6、记抗体Ab-L，以形成“三明治”式的夹心免疫复合物。样品中存在的Ag越多，结合的Ab-L也越多，夹心免疫复合物的标记荧光信号就越强。反应过程如下：如乙肝抗原的酶免疫检测示意图如下：3有机荧光染料在荧光免疫分析中的应用3.1有机荧光染料标记物标记物的选择对免疫分析的灵敏度和选择性至关重要，筛选性能优良、灵敏度高且易标记的标记物一直是免疫分析的研究课题。荧光免疫分析的标记物大致可分为三类：有机荧光染料、酶和无机金属配合物。目前常用的有机染料标记物是荧光素类以及罗丹明类染料。这些染料量子产率较高，并且荧光分子的激发、

7、发射波长一般都在紫外或可见光区域内。一般来说，这种荧光染料通常是芳香性化合物，其共同特征是：含有大π共扼键、具有刚性的平面结构、最低的单线电子激发态为π、π*型、芳香环上取代基一般为给电子的取代基团。但是，这些荧光染料也存在着一些不足如斯托克斯位移较小，对样品激发光的散射光敏感，其自发荧光导致噪音较高，使检测灵敏度下降。此外，有机荧光染料分子如荧光素较易自猝灭。在一定范围内，荧光分子在一个蛋白分子上标记的数目越多，其荧光强度反而下降。当多个荧光分子连接到蛋白分子上时，荧光分子间会发生能量传递，从而也会导致荧光碎

8、灭。有机荧光染料光谱性质具有如下特点：较窄的激发波长使其对激发光源选择性太强，很多情况下较难激发。而其宽的发射波长范围且其在长波区域的托尾现象会导致在不同检测通道之间带来的光谱的相互干扰。此外，其激发、发射波长较大程度的重叠，在检测发射光时会受激发光的影响，从而影响检测。在一些情况下，背景物质在激发光源的激发下，本身也能发出荧光，从而会导致背景与待检测物质的荧光相互干扰，给检测造成一定