柑橘采后腐烂主要致病菌的分离鉴定及丁香精油对其抑制作用研究.doc

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1、柑橘采后腐烂主要致病菌的分离鉴定及丁香精油对其抑制作用研究柑橘采后腐烂主耍致病菌的分离鉴定及丁香精油对其抑制作用研究摘耍：【目的】为了确定浙江宁海本地柑橘优势腐败菌及丁香精油对其的抑菌效果，【方法】从自然腐烂的柑橘上分离优势菌，采用传统真菌形态学鉴定方法结合rDNA-ITS序列分析方法进行鉴定，并采用体外试验研究丁香精油对优势菌的抑菌效果。【结果】结果表明，浙江宁海本地柑橘分离所得6株真菌分别为指状青霉(Penicilliumdigitatum)>柑橘链格抱(Alternariacitri)>枝抱样枝

2、抱霉(Cladosporiumcladosporioides)>聚多曲霉(Aspergillussydowii)>近玫色锁掷抱酵母(Sporidioboluspararoseus)和卡利比克毕赤酵母(Pichiacaribbica)；其中P.digitatum和C.cladosporioides是优势腐败菌；体外抑菌试验表明，丁香精油对P・digitatum和C.cladosporioides有较好的抑菌效果，抑制中浓度(EC50)分别为2.51mL・L-1和0.57mL・L-1；最小抑菌浓度(MIC

3、)分别为6mL・L-1和3mL・L-1。【结论】丁香精油可以抑制柑橘采后主要病原菌的生长。关键词：柑橘；优势菌；分离鉴定；rDNA-ITS；丁香精油中图分类号：S666文献标志码：A文章编号：1009-9980?穴2013?雪01-0134-06浙江是全国柑橘的主要产地之一，但是在柑橘采后贮藏过程屮，真菌引起的病害造成约10%的损失或者更高，带来了口大的经济损失。国内外学者认为,指状青霉(Penicilliumdigitatum)和意大利青霉(Penicilliumitalicum)是引起柑橘采后腐烂

4、的主要真菌［1］。对柑橘等果实采后主要致病菌的分离鉴定，是选择采后防腐保鲜方法的前提。目前对真菌的鉴定主要采用传统形态学方法，该方法市于经验、时间等限制，在实践中有一定的困难。近年随着分子生物学的发展，分子手段被广泛地应用于真菌的分类鉴定，特别是rDNA-ITS分子标记法。真菌rDNA的引物ITS1和ITS4适用于大多数担子菌和子囊菌的检测。而由于真菌核酸序列的rDNA在18s、28s区域具有保守性，在ITS区段又存在在属、种水平上的差异［2］。因此通过对ITS区进行扩增测序，來检测病原真菌的技术已越

5、來越被广泛应用［3］o丁香为桃金娘科植物丁香(EugeniaCargophyllataThunb)的干燥花蕾，是我国的传统中药。丁香精油含有丁香酚、乙酰丁香酚、丁香烯等成分，对葡萄灰霉菌、链格抱、桔青霉等多种病原菌具有较强的抑制作用［4-7］o有研究表明丁香精油对苹果的采后贮藏有明显的保鲜效果［8］,但丁香精油在柑橘防腐保鲜上的研究鲜见报道。我们拟从浙江宁海本地产柑橘上分离优势菌，采用传统真菌形态学分类鉴定结合rDNA-ITS分子标记法对所分离到的菌株进行鉴定，以确定地产柑橘的优势腐败菌；同时，进一步

6、分析丁香精油对柑橘主要优势腐败菌的抑制效果，以期望将丁香精油这一绿色防腐保鲜方法应用于柑橘采后病害的防治。1材料和方法1・1材料柑橘品种为早熟宫川，选择浙江宁海柑橘果园树上自然发病和采后贮藏过程中自然腐烂的果实。丁香精油纯度95%以上，购自成都科帝亚试剂有限公司。1.2柑橘采后优势菌的分离从口然发病的柑橘果实病健处切取果皮组织，用75%的医用酒精消毒1min,无菌水冲洗下抱子接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA),25°C培养［9］。经多次划线分离得纯种菌株。1.3菌株致病性检测将纯化培养的菌株用无菌

7、水配制成菌悬液，调至105个・mL-lo将柑橘果实用2%次氯酸钠溶液消毒2min,清水洗净，用消毒接种针在柑橘果实赤道处刺一个直径3mm、深3mm的伤口，在伤口处分别接种20uL抱子悬浮液，晾干，于25°C培养观察果实发病情况。根据柯赫氏法则，检测菌株的致病性。1.4菌株传统形态学观察将培养7d的菌落，挑取边缘菌丝放在滴有乳酸石炭酸棉蓝染色液的载玻片上，置于显微镜下观察［10］。1.5菌株rDNA-ITS序列分析1.5.1DNA的提取将纯化所得的6株菌接种于马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB),25°C、

8、140r・min-1培养3d后，6000r・min-1离心10min,取少量菌丝，用真菌基因组DNA快速抽提试剂盒(上海生工生物有限公司)提取DNA,按说明书操作。1.5.2基因序列的测定采用通用引物ITS1(5‘-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)与ITS4(5‘-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')进行PCR扩增。PCR反应体系：dNTP4uL,10XPCRbuffer5nL(含15mmol・L-l镁离了），引物各1pL,Ta