基因重组蛋白纯化流程.doc

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1、01.11周总结一、本周工作01．0520T—TB23蛋白处理1、分析昨天20T—TB23蛋白跑小胶的情况，硫胺分析上清基本无目的蛋白，因此放弃处理上清；2、沉淀中目的蛋白比较明显，观察小胶2M尿素溶解上清中目的蛋白较少，6M、8M溶解的沉淀中目的蛋白量较少，因此考虑用2M尿素去杂蛋白，用6M尿素洗目的蛋白；3、用正常Buffer将沉淀再洗两遍，用15ml/PBuffer溶液将沉淀吹起，超声2min,12000rpm离心15min,再重复一遍；4、用30ml2M尿素溶液（含20mmol/LTris--Hcl）将沉淀吹起，超声2min,12000rpm离心15min，弃上清；5、

2、用15ml6M尿素溶液将蛋白吹起，超声2min,冰箱中放置2h，超声2min,12000转离心30min;6、将上清倒至一洗净的烧杯中，取上清测蛋白浓度，往上清中加7.5ml的5*loadingbuffer,取40微升跑粗抗胶，其余放到冰箱等待上大胶；7、将大胶夹好后，用注射器往每板大胶中加3微升样品，进行电泳；20T—I56II12菌体回收1、该蛋白共两瓶，平均装入3只大离心管中，7000rpm离心3min；2、去上清用20ml裂解液吹起，超声破碎3*4min,观察蛋白溶液显白色，预计为沉淀表达;3、12000rpm离心25min，去上清，沉淀放冰箱明天处理；01.0620T

3、—TB23蛋白回收：1.将跑20T—TB23蛋白的凝胶从电泳槽上拆下，观察凝胶上的蛋白带；2、用手术刀轻在蛋白带上画一条线，描出蛋白的前带；3、用手术刀以垂直于蛋白带的方向在凝胶中间切下一条宽1cm左右的条带，在条带的末尾用手术刀切成不同的形状，以便区分，将凝胶条放到氯化铜染色液中染色；4、染色完成后根据凝胶条上目的蛋白染色的宽度确定凝胶上目的蛋白的宽度与位置；5、根据染色后目的蛋白的分布，确定切胶的宽度和上让、下让的宽度，用手术刀将目的蛋白条从凝胶上切下，用蒸馏水冲洗几遍；6、将含目的蛋白的凝胶条放到透析袋中扎紧袋口，在放1*SDS缓冲液的电泳槽中电洗脱2H；7、电洗脱后收集

4、目的蛋白溶液，稀释12倍后，紫外分光光度计测浓度，280nmOD值为0.165,260nmOD值为0.098，C=（0.165*1.45—0.098*0.74）*12=2.0；20T—I56II12蛋白处理：1用正常Buffer将沉淀再洗两遍，用15ml/PBuffer溶液将沉淀吹起，超声2min,12000rpm离心15min,重复两遍；2、用30ml2M尿素溶液（含20mmol/LTris--Hcl）将沉淀吹起，超声2min,12000rpm离心15min，弃上清；3、查以前的实验记录，用10.4ml8M尿素溶液将蛋白溶解，超声2min,冰箱中4度放置2h，超声2min,1

5、3500转离心30min;4、将上清倒至一洗净的烧杯中，取上清稀释24倍测蛋白浓度，280nmOD值为1.041,260nmOD值为0.579，C=（1.041*1.45—0.579*0.74）*24=25.9；往上清中加2.6ml的5*loadingbuffer,取40微升于1.5ml离心管中跑粗抗胶，其余放到冰箱等待上大胶；7、将大胶夹好后，观察粗抗胶的染色情况，用注射器往每板大胶中加3微升样品，共加4板，进行电泳01.07协助回收20T—I56a、20T—I56、20T—I56bII12蛋白1．准备好切胶所需的玻璃板，手术刀、镊子等器具，用纯水洗净后整齐摆放在切胶台上（不

6、能直接接触切胶台，要用干净纸巾垫好）；2、将凝胶板从电泳槽上拆下，观察凝胶上的蛋白前带，用手术刀沿前带轻轻描一条线；3、在垂直于蛋白带的方向在凝胶中间切下一条1cm左右的凝胶条放在5%Cucl2溶液中染色，染色过程中注意轻轻摇晃染色盒；4、染色后观察目的蛋白在凝胶上的位置、确定切胶的宽度；5、用手术刀将目的蛋白带切下，切胶过程中注意不要产生碎渣，并用纯净水将切下的凝胶条冲洗干净；6、将切下的凝胶条放在透析袋中，加适量缓冲液扎紧袋口，在电泳槽中电洗脱2h之后，反插导线洗脱5min；7、洗脱后回收透析袋中的蛋白溶液，稀释12倍后测蛋白溶度，放冰箱4°C保存。01．09破碎分析P4—

7、HB85P25—6蛋白：1、测菌浓度，取4只比色皿往第一个比色皿中用800微升移液枪打入2.4ml纯净水作为对照管，其它几个比色皿中加入1.6微升纯水后，再加入800微升的菌液混匀，注意每取一个细菌培养液时要更换一次移液枪头，将比色皿放在紫外分光光度计中在600nm波长条件下检测OD值为0.856；2、制作大表：取1.5ml菌液于离心管中12000rpm离心2min吸去上清往离心管中加入40微升水，20微升3*loadingbuffer，注意吹匀沸水煮10min,12000rpm离心6min