利迪链霉菌A02高产纳他霉素工程菌的选育.pdf

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1、HIGHPRoDUCINGNATAMYCINSTREPToMYCESLYDICUS叁内2ENGINEEIUNGSTRAINSBREEDINGADissertationSubmittedtotheGraduateSchoolofHenanNormalUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofScienceByLiuHuiSupervisor：Prof．WangLinsongMay2014摘要lllllllllllllllJllllbllJllllllllllJlllblllllll哪Y2550

2、595利迪链霉菌(Streptomyceslydicus)A02是北京市农林科学院从京郊菜园泥土中筛选到的一株放线菌，研究发现该菌株对多种病原真菌均有较强抑菌活性，进一步分离鉴定表明，该菌株能够合成多烯大环内酯类抗生素纳他霉素。为提高菌株纳他霉素产量使其更好地应用于农业病害防治中，本课题对利迪链霉菌A02进行以下三方面的研究：～是采用基因工程手段使透明颤菌血红蛋白Ⅳm)基因在利迪链霉菌A02中得到表达，并研究其对生长代谢的影响：二是对工程菌株AV02的发酵条件进行初步优化：三是应用基因工程技术对利迪链霉菌A02次级代谢调控中的负调控基因进行敲除，并研究其对出发菌株纳他霉素合成的影响。主

3、要研究结果如下：(1)以整合有链霉菌组成型表达的强红霉素抗性基因启动子的表达载体pIBl39为出发质粒，将透明颤菌血红蛋白基因(vgb)克隆到plBl39质粒，然后通过接合转移的方式将整合载体plBl39一vgb转入利迪链霉菌岱lydicus)A02，经过抗性筛选和PCR验证，得到利迪链霉菌A02VHb基因表达菌株AV02。采用不同装瓶量摇瓶发酵，结果表明：vgb表达可促进菌体的生长和次级代谢产物的合成。HPLC检测发酵液中纳他霉素产量比原始菌株提高84％。(2)通过对工程菌株AV02的摇瓶发酵实验，确定了最优的发酵条件：种龄2仁30h、培养温度28"C、发酵初始pH值7．0、装液量1

4、0％、接种量6％、转速220rpm。并在此培养条件下向发酵培养基中添加终浓度为0．2％的碳酸钙，0．05％的硫酸镁，其纳他霉素产量比基础发酵培养提高了20％。(3)通过同源比对，扩增出利迪链霉菌A02双组分调节系统phoP-phoR基因。通过PCR、酶切连接将目的片段克隆到链霉菌改造后的敲除载体pKGl139，通过接合转移到利迪链霉菌A02。经CMC．Na平板检测和抗性标记初筛，PCR克隆相关基因进一步筛选，得到链霉菌A02phop缺失菌株AphoP-A02。经摇瓶发酵，纳他霉素产量比出发菌株提高了一倍，最高可达6g／L。关键词：利迪链霉菌；纳他霉素；菌种改良：v96；接合转移；敲除A

5、BSTRACTStreptomyceslydicusA02，isolatedfromthesoilofsuburbanvegetablefieldinBeijing，presentedasgonginhibitoryactivityagainstseveralplantpathogenicfungi．Furtherisolationandidentificationshowedthatthestraincansynthesizepolyenemacrolideantibioticnatamycin．Toimprovetheproductionofnatamycinandapplyitw

6、idelyinagriculturaldiseaseprevention，Inthispaper,yieldnatamycinofS．1ydicusA02Wasimprovedinthefollowingaspects．Firstly，weexpressedvgbgeneinS．1ydicusA02andinvestigatedtheeffectongrowthandmetabolismofthestrain．secondly，weoptimizefermentationconditionsofengineeringstrainpreliminary．thirdlywedeletene

7、gativeregulatorgenecontrolledsecondarymetabolismofS．1ydicusA02byknock-outtechnologyandresearchtheinfluenceonnatamycinsynthesis．Themainresultsareasfollows：(1)ArecombinantplasmidplB139whichWasintegratedwiththepromoteroferythro