AAV在肝脏及眼部中的应用.doc

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1、AAV在肝脏及眼部疾病基因治疗中的应用基因治疗是近年来随着现代分子生物学技术的发展而诞生的新的生物医学治疗技术，其基本原理是，将外源基因即治疗基因通过载体系统导入靶细胞后，与宿主细胞内的基因发生整合，成为其遗传物质的一部分，以纠正或补偿基因缺陷或缺失引起的疾病，从而达到治疗目的[1]。基因治疗载体在基因治疗过程中起着至关重要的作用，目前常用的基因治疗载体主要包括病毒类和非病毒类两种。病毒类载体是当今基因工程研究的热点之一，主要包括取代型的重组病毒载体和重组的病毒质粒载体，包括逆转录病毒、腺病毒及腺相关病毒(adeno-ass

2、ociatedvirus,AAV)。重组腺相关病毒（rAAV）以其安全性好、宿主范围广、免疫原性低、携带外源基因可长期表达等优点而备受关注[2]，广泛应用于人类和动物相关疾病的基因治疗，本文将对rAAV在肝脏和眼部疾病的基因治疗中的应用进行综述。1. AAV的生物学特性1.1AAV基因组结构和功能AAV属于细小病毒家族的依赖病毒属，是动物病毒中最小的病毒，最早于1965年作为腺病毒制备物中的一种污染成分被发现。其基因组为4.7kb左右的单链DNA片段，包含于直径20nm的正二十面体非包膜病毒衣壳中，可分成三个功能区域：两个开

3、放阅读框（Rep基因、Cap基因）和末端反向重复序列（ITRS）。Rep基因的开放阅读框编码4个多功能非结构蛋白家族（Rep）蛋白，即Rep40、Rep52、Rep68与Rep78，主要功能涉及病毒/载体基因组的复制、转录的调控、整合以及AAV基因组的组装[3,4]。Cap基因的开放阅读框编码三个衣壳蛋白VP1、VP2和VP3，分子量为别为87、73、61kDa，是装配成完整病毒所需的衣壳蛋白，它们在病毒整合、复制和装配中起重要作用[5]。衣壳蛋白序列之间的差异导致不同血清型的AAV与不同的细胞表面受体结合，这使得不同 AA

4、V血清型具有不同的组织嗜性[4,6]。末端反向重复序列（ITRS）在AAV基因组的5’和3’末端形成两个T字形结构，作为复制起点并在病毒基因组整合入宿主基因组，在随后的从整合状态中拯救病毒DNA的过程中均发挥了非常关键的作用[7]。AAV是一种缺陷性病毒，不能独立存在，只有在辅助病毒如腺病毒（Ad）、单纯疱疹病毒（HSV）等存在的条件下，才能在感染的宿主细胞中复制合成装配蛋白，产生新的病毒颗粒。当无辅助病毒存在时，野生型AAV只能被定点整合到宿主细胞第19号染色体长臂上，形成潜伏性感染，病毒DNA随宿主细胞染色体的复制而复制

5、，无AAV颗粒产生[8-10]。1.2AAV的血清型目前发现的AAV基因型有200多种，根据抗原性的差异分为不同的血清型，在人类中共发现AAV1~AAV11、DJ等12种不同的血清型[11,12]。不同血清型主要区别在于衣壳蛋白Cap的不同，并决定不同血清型AAV对不同的组织和细胞有不同的感染效率。研究表明，肝脏亲和性高的AAV血清型主要有AAV7、AAV8、AAV9，其中AAV8在目前应用的AAV载体中嗜肝性最强，携带目的基因的载体在动物体内可以形成稳定的肝脏转染，常被用作肝脏的相关研究（12-17）；AAV1、AAV2、

6、AAV5血清型均可有效转染主感光器和视网膜色素上皮细胞，用于治疗眼部疾病。AAV2是人体中主要存在的血清型，正常人群中超过80%存在AAV2的中和抗体，因而临床上应用AAV2会导致治疗效果受限[13]。1.3rAAV载体ITRS是AAV病毒基因组复制和包装成病毒颗粒所必需的唯一顺式作用元件，其他结构和非结构蛋白可通过反式作用提供。rAAV的构建通常涉及rep 和cap 基因的剔除和报告基因或治疗基因插入ITRs元件之间，产生的载体质粒随后与一个表达AAV的rep和cap基因的包装质粒一起共转染到组织培养细胞中。带有报告基因或

7、外源基因的重组AAV基因组就会被拯救、复制和包装成rAAV[11]，如图1所示。 图 1 AAV野生型及AAV载体基因组结构从1966年第一篇报道发现AAV是独立于腺病毒的新病毒起，到1984年第一篇应用rAAV为载体感染哺乳动物细胞的文章发表，rAAV作为一种新型病毒载体引起广泛关注，目前对其应用研究主要集中于以之为载体的基因治疗[10]。相关临床应用的推进过程较为慎重缓慢，将rAAV注射进机体组织中，可以在动物或人体内获得长期有效的转基因表达，所涉及的组织器官包括肌肉组织、造血干细胞、心血管系统、肿瘤组织、中枢神经系统、

8、呼吸道和肺的上皮组织等，其中最有效的是骨骼肌、脑、视网膜、肝脏、肠道固有层，所涉及的疾病包括ɑ1-抗胰蛋白酶缺乏症、老年性肌肉萎缩、凝血因子缺陷症、帕金森病、肿瘤等。但rAAV载体在应用时也要注意一些不足之处，如包装外源基因的容量小于4.7kb、滴度低和表达“滞后性”，即被转染细胞重组AA