生物化学第10章酶的作用机制和酶的调节.ppt

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1、第10章酶的作用机制和酶的调节一、酶的活性部位二、酶催化反应的独特性质三、影响酶催化效率的有关因素四、酶催化反应机制的实例五、酶活性的调节控制六、同工酶(mechanismsofenzymeactionandregulationofenzymeactivity)一、酶的活性部位酶活性部位的特点Ⅰ在酶分子中，只有少数几个氨基酸残基直接参与结合底物和催化反应，这些氨基酸残基在一级结构上可以相距很远，但通过肽链的折叠、盘绕，使它们在空间上相互接近。这些残基在空间上所在的部位称为活性部位（activesite）或活性中心（activecenter），酶的活性部位往往有

2、一个裂缝或口袋状的区域，其形状与底物相似。胰凝乳蛋白酶活性部位的结构57102195酶活性部位的特点Ⅱ当底物与酶通过次级键结合时，底物和酶都可能发生形变，诱导契合，使得底物与酶的活性部位的形状恰好吻合，而且负责催化反应的残基也正好接近将发生反应的基团或键。当酶蛋白变性时，构象发生变化，失去上述结构特点，同时也失去了活性。虽然酶蛋白中其它残基不直接参与活性部位的组成，但这些残基中的大多数为整个酶蛋白的构象作出了不可缺少的贡献。研究酶活性部位的方法酶分子侧链基团的化学修饰法（1）非特异性共价修饰（2）特异性共价修饰（3）亲和标记法2.动力学参数测定法3.X射线晶体

3、结构分析法4.定点突变法酶分子侧链基团的化学修饰法用一种小分子化合物与酶反应，这种化合物与酶的某个或某种残基侧链反应，形成共价结合，这叫化学修饰（chemicalmodification）或共价修饰（covalentmodification），这种化合物称为修饰剂。酶分子中可以被化学修饰的基团有：巯基、羟基、咪唑基、氨基、羧基和胍基等。当酶活性部位的残基侧链被修饰后，会使酶失去活力。将经修饰后失去活力的酶水解，鉴定出被修饰的氨基酸，可以得到哪些残基参与组成活性部位的信息。非特异性共价修饰此类修饰剂可以修饰活性部位内或外的残基侧链基团。若修饰程度与酶活力丧失成正

4、比，则说明被修饰的基团位于活性部位。当发现修饰程度与酶活力丧失成正比时，可在加入底物或竞争性抑制剂的条件下进行修饰，若加入底物或竞争性抑制剂可阻遏修饰剂对酶活力的破坏作用，则进一步证明被修饰的基团位于活性部位。特异性共价修饰此类修饰剂特异性地修饰酶活性部位的残基，同时使酶失活。此类修饰剂与酶的活性部位特异性结合，同时修饰酶活性部位的基团。例如二异丙基氟磷酸（DFP）能特异性地与许多酶的活性部位的Ser残基共价结合，使酶活力丧失，而不修饰非活性部位的Ser残基。当用DFP修饰酶后，部分水解酶蛋白，得到含有二异丙基磷酰基的肽段，分析此肽段的氨基酸序列，可得到活性部

5、位Ser附近的肽链序列。DFP修饰酶的Ser残基的反应几种丝氨酸蛋白酶活性部位的氨基酸序列酶氨基酸序列牛胰蛋白酶……Ser-Cys-Gly-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Val……牛胰凝乳蛋白酶……Ser-Cys-Met-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Leu……猪弹性蛋白酶……Gly-Cys-Gln-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Leu……猪凝血酶……Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro……亲和标记法能特异性地修饰酶的活性部位的修饰剂很少，并且专一性差，经常出现也修

6、饰活性部位之外的残基的情况。为了解决此问题，人们合成了一些底物类似物，其上带有高反应性基团，它们特异地与相应的酶的活性部位结合，然后与活性部位的残基反应，这样就大大提高了修饰的专一性，这种方法叫亲和标记法。TPCK对胰凝乳蛋白酶的亲和标记最典型的例子就是用来修饰胰凝乳蛋白酶的亲和标记物对甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲基酮（TPCK），胰凝乳蛋白酶的人工底物是对甲苯磺酰-L-苯丙氨酸乙酯（TPE）。当将TPDK与胰凝乳蛋白酶一起保温后，酶失去活性，氨基酸分析表明，TPDK修饰了His57。TPCK不与胰凝乳蛋白酶原、变性的胰凝乳蛋白酶、DIP-胰凝乳蛋白酶反应。这些

7、证据说明His57是组成酶活性部位的残基之一。TPE和TPCK的结构亲和标记物人工底物动力学参数测定法在不同pH下测定酶活力，可以得到与酶活力直接相关的可解离基团的pKa值，从而推测出是些什么残基。X射线晶体结构分析法使底物与酶结合，制成晶体，再进行X光晶体衍射分析，可得到底物附近有哪些残基。定点突变法从基因的水平上对蛋白质编码序列中特定位点的核苷酸进行突变，使得蛋白质特定的氨基酸残基转变成另一种氨基酸残基，观察突变对酶活力的影响。例如，1987年Claik将胰蛋白酶Asp102突变成Asn102，突变的胰蛋白酶的kcat只有野生型酶的五千分之一，突变酶水解酯

8、底物的活力仅是野生型酶的万分之一，可见