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1、聚合酶链式反应（PCR）原理：DNA的半保留复制时，双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验条件下，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。PCR类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火(复性）-延伸三个基本反应步骤构成：①模板DN
2、A的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至40~60℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板-引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于72℃左右，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新
3、链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。PCR技术分类（常用）（1）反向PCR技术(InversePCR,IPCR)：反向PCR是克隆已知序列旁侧序列的一种方法．主要原理是用一种在已知序列中无切点的限制性内切酶消化基因组DNA．后酶切片段自身环化．以环化的DNA作为模板，用一对与已知序列两端特异性结合的引物，扩增夹在中间的未知序列。该扩增产物是线性的DNA片段，大小取决于上述限制性内切酶在已知基闲侧翼DNA序列内部的酶切位点分布情况。用不同的限制性内切
4、酶消化，可以得到大小不同的模板DNA，再通过反向PCR获得未知片段。（2）锚定PCR技术(AnchoredPCR,APCR)：用酶法在一通用引物反转录cDNA3’-末端加上一段已知序列,然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行扩增,称为APCR。（3）不对称PCR技术(asymmetricPCR)：两种引物浓度比例相差较大的PCR技术称不对称PCR。在扩增循环中引入不同的引物浓度,常用50～100÷1比例。在最初的10～15个循环中主要产物还是双链DNA,但当低浓度引物被消耗尽后,高浓度引物介导的PCR反应就
5、会产生大量单链DNA。（4）反转录PCR技术(reversetranscriptionPCR,RT-PCR)：当扩增模板为RNA时,需先通过反转录酶将其反转录为cDNA才能进行扩增。应用非常广泛,无论是分子生物学还是临床检验等都经常采用。（5）巢式PCR技术(NEST-PCR)：先用一对靶序列的外引物扩增以提高模板量,然后再用一对内引物扩增以得到特异的PCR带,此为巢式PCR。若用一条外引物作内引物则称之为半巢式PCR。为减少巢式PCR的操作步骤可将外引物设计得比内引物长些,且用量较少,同时在第一次PCR时采用
6、较高的退火温度而第二次采用较低的退火温度,这样在第一次PCR时,由于较高退火温度下内引物不能与模板结合,故只有外引物扩增产物,经过若干次循环,待外引物基本消耗尽,无需取出第一次PCR产物,只需降低退火即可直接进行PCR扩增。这不仅减少操作步骤,同时也降低了交叉污染的机会。这种PCR称中途进退式PCR，主要用于极少量DNA模板的扩增。（6）多重PCR技术(multiplexPCR)：在同一反应中用多组引物同时扩增几种基因片段,如果基因的某一区段有缺失,则相应的电泳谱上这一区带就会消失。主要用于同一病原体的分型及同
7、时检测多种病原体、多个点突变的分子病的诊断。（7）重组PCR技术：重组PCR技术是在两个PCR扩增体系中,两对引物分别由其中之一在其5’-端和3’-端引物上带上一段互补的序列,混合两种PCR扩增产物,经变性和复性,两组PCR产物互补序列发生粘连,其中一条重组杂合链能在PCR条件下发生聚合延伸反应,产生一个包含两个不同基因的杂合基因。（8）原位PCR技术：利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片
8、在单个细胞中进行ＰＣＲ扩增，可进行细胞内定位，适用于检测病理切片中含量较少的靶序列。（9）荧光定量实时PCR技术反应动力学PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升，最终DNA扩增量可用Y=(1+X)n计算，Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平均每次的扩增效率，n表示循环次数。平均扩增效率理论值为100%，但实际情况达不到，反应初期靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着
