人胃螺旋菌的分离培养研究.doc

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1、人胃螺旋菌的分离培养研究人胃螺旋菌（Gastrospirillumhominis,GH）是近来人们认识到的除幽门螺杆菌（Helicobacterpylori,Hp）夕卜的另一类与人胃炎有关的微生物,国内报道人群感染率明显高于国外。由于H前国内外对GH尚未分离培养成功，对Gh的研究仅限于组织学及形态学观察，影响了对Gh本身及其致病性方而的深入认识。我们自一接受胃镜检查的病人屮，观察到有Gh和Hp混合感染存在，并最终纯化分离到了Gh和Hp。在对Gh的传代培养屮，我们较系统地观察了不同培养条件及冷冻保存对其形态等的影响

2、。现简要报告如下。1材料和方法1.1标本来源实验标本来源于一位在首都医学院附属天坛医院接受胃镜检查的50岁的男性病人，病理堂检查证实其胃粘膜是屮度慢性浅表性胃炎伴屮度活动性胃炎表现。胃镜检查时在胃窦部钳取胃粘膜组织2块，置于含10%小牛血清的布氏肉汤小，放于4。C保存4d后进行以下实验。1.2胃粘膜组织尿素酶试验参考Christensen尿素肉汤培养和Morris等快速诊断法，采用2%液体尿素常规法，于4h及24h观察结果。1.3细菌分离培养及纯化在灭菌研磨器屮将胃粘膜组织研磨成匀浆，涂于含6%脱纤维绵羊血的布氏

3、琼脂平板（含TMP5mg/L,万古霉素6mg/L及多粘菌素B4mg/L）屮，将平板置于含10%C022>5%02及85%血的混合气体培养箱中,37°C培养3d后涂片,在光镜下观察培养结果。在含10%脱纤维绵羊血的布氏琼脂平板屮进行Gh菌单菌落纯分离,并测定其尿素酶、氧化酶及过氧化氢酶活性。1.4不同培养条件下Gh生长情况①将纯化的Gh菌分别接种于含6%与10%脱纤维绵羊血的布氏琼脂平板小，置混合气体环境，37°C培养3d,涂片检査细菌形态。②将纯化的Gh菌接种于含6%脱纤维绵羊血的布氏琼脂平板屮，局部分别滴加灭菌

4、的布氏肉汤、新鲜脱纤维绵羊血及冻融脱纤维绵羊血，并分别加盖一片灭菌的盖玻片，使覆盖部位呈厌氧状态。放37。C培养3d,观察细菌菌落生长情况及涂片观察细菌形态。③将纯化的Gh菌接种于含10%小牛血清的布氏肉汤小管屮（管口加灭菌绵塞），放混合气体环境，37°C培养3d后，直接涂片及离心沉渣涂片观察细菌形态。④将置于保存液（含10%蔗糖和50%小牛血清）中,-70°C保存30d后的Gh菌,接种于含10%脱纤维绵羊血的布氏琼脂平板屮，37。C培养3d后，观察菌落生长情况、涂片观察细菌形态、测定其尿素酶、氧化酶和过氧化氢酶

5、活性，并继续传代观察其形态变化。2结果胃粘膜组织尿索酶试验4h及24h均为阴性。细菌初代培养物涂片发现含有Gh和lip两种菌。经单菌落分离分别得到Gh和lip菌的纯培养，其屮分离到的Gh菌株命名为Gh32o对Gh32的测定发现其氧化酶与过氧化氢酶均为阳性。并含有很强的尿素酶活性。Gh32在含有6%脱纤维绵羊血的布氏培养基上生长较差，菌落呈针尖状。光镜下可见细菌呈球形、肾形及短螺旋形，多数菌仅一个弯曲。在含10%脱纤维绵羊血的布氏培养基上生长良好，可长成lrnin〜2mm直径单个菌落,光镜下可见细菌呈多螺旋状，螺旋

6、数H在1〜6个之间，且螺旋较密。Gh32在盖玻片下生长不良；在滴加布氏汤和未滴加任何液体的对照部位，细菌菌落较小，呈针尖状。在滴加新鲜血或冻融血而未被盖玻片覆盖处，菌落形态及光镜下细菌形态与在含10%脱纤维绵羊血布氏琼脂平板上生长的情况和似。Gh32在液体培养吋生长较慢，3d后液体仅轻度混浊，涂片发现细菌数Fl较少，但菌形良好，螺旋数在3〜14个不等，长度可达17um左右。经3,000r/min(台式离心机上)离心亦讪后沉渣用少许生理盐水悬浮涂片发现，多数细菌螺旋数在4〜6个左右。将低温保存Gh32初代复活时，菌

7、落生长良好。酶活性检査发现，其尿素酶、氧化酶及过氧化氢酶均为阳性。涂片发现儿乎所有菌体均发生了球形变。连续传代2次后，70%左右恢复典型形态，连续传代3次后细菌几乎全部恢复其典型形态。3讨论人们对胃螺旋菌的认识己有一个较长的历史过程。早在1881年Rappin就报道在狗胃粘膜屮观察到螺旋形细菌的存在，此后乂有许多在其它哺乳动物胃粘膜屮观察到螺旋形细菌存在的报道。1906年Krienitz首先观察到人胃粘膜屮有3种不同类型的弯曲或螺旋细菌存在，但此后胃螺旋菌未能引起人们的足够重视。随着对幽门螺杆菌与胃炎及消化性溃疡

8、的关系的深入研究，人们开始重新对人胃螺旋菌进行认识。H前认为此菌可能为除Hp外的又一类与胃炎有关的细菌。H1987年来世界各地己有近百例有关Gh感染的报道，国内杨海涛等也曾报道14例Gh感染病人。人们口猪等动物己成功地分离到了胃螺旋菌，近年来国内外多位学者曾对Gh进行分离培养，但至今未见有关Gh培养成功的报道，对Gh的研究也仅限于对病理组织学的观察。我们自人胃粘膜组织屮成