生物制药第八章多肽与蛋白质类药物2.ppt

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1、第八章多肽与蛋白质类药物三、干扰素干扰素(Interferon，IFN)最早是由英国科学家Isaacs和Lindemann于1957年在研究病毒干扰现象时发现的。1965年发现了白细胞干扰素，1969年发现了致敏细胞干扰素。3.1干扰素的定义1980年，国际干扰素命名委员会对干扰素下的定义为：干扰素是一种在同种细胞上具有广谱抗病毒活性的蛋白质。现在，一般指脊椎动物细胞受干扰素诱生剂作用后合成的一类具有细胞功能调节作用的蛋白。3.2分类干扰素在整体上不是均一的分子，可根据其来源细胞不同，分为白细胞干扰素(IFN-α)、类淋巴细胞干扰素(IFN-α

2、与IFN-β的混合物)、成纤维细胞干扰素(IFN-β)、T细胞干扰素(IFN-γ)等几类。IFNα型干扰素又以其结构不同再分为IFNαⅠb、IFNαⅡ和IFNαⅡb等亚型。3.3干扰素的作用①抑制病毒等细胞内微生物的增殖；②抗细胞增殖，③通过作用于巨噬细胞、NK细胞、T淋巴细胞、H淋巴细胞而进行免疫调节；④改变细胞表面的状态，使负电荷增加，组织相容性抗原表达增加；⑤增加细胞对双链DNA的敏感性。3.4传统方法生产干扰素１．传统方法生产工艺流程：利用血库血大量制备人血细胞干扰素。２．工艺过程及控制要点①分离灰黄层取新鲜血液(一般每份400ml)，

3、加入ACD抗凝剂，离心后分离出血浆，小心吸取灰黄层。每份血可吸取13~15ml，放置4℃冰箱中过夜。②氯化铵处理每份灰黄层加入30ml缓冲盐水，再加入9倍体积量的冷的氯化铵溶液(0.83％)，混匀，4℃放置10min，然后在4℃离心(8000r/min)20min。小心弃去上清液，再用9倍量的0.83％氯化铵液重复处理1次，溶解残存的红细胞。取沉淀的白细胞并悬于培养液中，置于冰浴，取样作活细胞计数，用预温的培养液稀释成每毫升含107个活细胞。③启动诱生取稀释的细胞悬液加入白细胞干扰素，使其最后浓度为100µg/ml置37℃水浴搅拌培养2h。④正

4、式诱生启动后的白细胞加入仙台病毒(在10天龄鸡胚中培养48~72h，收获尿囊液)使其最后浓度为每毫升100~150血凝单位，在37℃搅拌培养过夜。⑤收获将培养物离心(2500r/min)30min，吸取上清液即得粗制干扰素。⑥纯化将粗制人白细胞干扰素加入硫氰化钾0.5mol/L，用2mol/L盐酸调节pH=3.5，离心弃去上清液，得沉淀1。沉淀1加入原体积1/5量的冷乙醇(94％)，离心弃沉淀得上清液1。上清液1用盐酸调节pH=5.5，离心弃去沉淀，再调至pH=5.8，离心，得上清液2和沉淀2。沉淀2加入原体积1/50量的甘氨酸-盐酸缓冲液(p

5、H=2)溶解，检测，得IFN1。上清液2调节pH值至8.0，离心弃去清液，得沉淀3。沉淀3加入原体积1/50量的0.1mol/LPBS，0.5mol/L硫氰化钾(pH=8)溶解，pH值降至5.2，离心得上清液3和沉淀4。沉淀4加原体积l/25000量pH=8.0的0.1mol/LPBS溶解，调至pH=7~7.5，对PBS(pH=7.3)透析，过夜，离心，收集上清液，检测，得IFN-B。上清液3中加盐酸使pH值降至3.0，离心，得沉淀5。沉淀5加入原体积1/5000量的pH=8、0.1mol/LPBS溶解，加NaOH调节pH=7~7.5，对PBS

6、(pH=7.3)透析过夜，离心收集上清液，检测，得IFN-A。每份灰黄层约能制备100万单价的纯化干扰素。此法特点是一次纯化量大，回收率高于60％；经济，简便，易于普及。效价可达1.2×108U/ml，比活2.2×106U/mg(蛋白)。IFN-A中干扰素含量占回收干扰素的82％，比活也比较高。IFN1的比活较低[5×104U/mg(蛋白)]，一般可作外用滴鼻剂或点眼剂等。3.5基因工程干扰素的生产1973年Cohen将两种不同的DNA分子进行体外重组，并用大肠杆菌表达，使大量、廉价制备单组分干扰素成为可能。1980年和1982年利用基因工程成

7、功地获得了IFN-α、IFN-β和IFN-γ的cDNA，标志着第二代干扰素的诞生。1987年，3种干扰素的生产开始工业化，并大量进入市场。１．克隆及基因文库的构建干扰素的基因文库构建一般是用诱导剂对可以产生干扰素的肿瘤细胞株进行诱导，从中取出mRNA，通过相应的引物对干扰素的mRNA进行逆转录-PCR扩增，将其与一定的质粒相连接后用合适的宿主菌进行培养、扩增即可。以从Namalva细胞中克隆IFN-α、β为例。将Namalva细胞用Senda病毒诱导后从上清中用酚提取mRNA，通过oligo(dT)纤维素柱纯化及5％~20％(W/V)蔗糖密度梯

8、度离心25000r/min20h后取6~18S的组分。用逆转录酶合成第一条互补链后用DNA聚合酶Ⅰ合成第二条链，用核酸酶S1切成平头末端后5％~20％