内皮细胞培养溶液配制.doc

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1、人脐带静脉内皮细胞的分离与培养试剂:血清、胰蛋白酶/胶原酶、PRMI培养粉、青、链霉素三蒸水、EDTA（乙二胺四乙酸二钠）、HCL、NaOH、NaCL>KCL、Na2HPO4.H2O>NaHCO3、台盼蓝器材：超净工作台、压力蒸汽消毒器、电热干燥箱、滤器、CO2培养箱、倒置显微镜、手术器械、水浴锅、温度计、磁性搅拌器、离心机、电子天平、血细胞计数板耗材:储存瓶、培养瓶，吸管、滴管，烧杯、量筒、粗细线、牛皮纸、饭盒、静脉插管、胶塞、离心管溶液配制1.水：新鲜配置的三蒸水2.PBS平衡盐溶液（工作液液）NaCL80.0gKC

2、L4.0gNa2HPO4.H2O0.6gKH2PO40.6g以上药品溶于1000ml三蒸水。N"HCO3调PH到7.2,工作台内过滤后分装，一20°C冻存。4°C解冻备用。1.0.25%胰蛋白酶称取酶粉0.25g,加入100mlPBS工作液（注：不能用蒸馆水）,磁力搅拌完全溶解，过夜，工作台滤过除菌，分装，一20°C冻存。1.胎牛血清灭活（消除补体活性）：56°C,30分钟摇匀后直接分装。2.青霉素、链霉素一般市售的青霉素为80万单位/瓶，将其溶解在4ml三蒸水，每1000ml培养液中加0.5ml,最终使用浓度为每毫升1

3、00单位。一般市售的链霉索为100万单位/瓶，将其溶解在5ml三蒸水，每1000ml培养液中加0.5ml,最终使用浓度为每毫升100单位。3.10%血清RPMI-1640培养液RPMI-1640培养粉1袋(10.4g)碳酸氢钠2.0g青、链霉索各100单位/毫刃加三蒸水至1000ml,过滤除菌。调节pH值至7.2加血清（终浓度10%）实验步骤：1.取产后健康新生儿脐带（4D-Hanks保存），6小时内操作;2.超净工作台上无菌操作:操作端插上无菌静脉插管，细线固定，用注射器将D-Hanks冲洗脐静脉到无血液为止;夹闭另一

4、端，工作端注入37°C预热的胰蛋白酶10ml(37°C水浴锅消化10');1.lOOOrpm离心10J弃上清，加入含10%血清培养液适量，吸管轻轻吹打，制成细胞悬液;2.种入培养瓶中，在培养箱中培养观察。试剂及部分耗材清单名称规格参考价格(元)青霉索8*106U35.00链霉素1g15.001640培养基1L40.00小牛血清100ml140.00胰蛋白酶10g95.00离心管10ml1个0・60封口膜4*125f180.00一次性薄膜手套包7.00滤器个5・50各种规格胶塞