整个基因克隆实验流程(完整).doc

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1、一、组织总RNA的提取相关试剂：Trizol；氯仿；苯酚；异丙醇；75%乙醇；RNase-free水相关仪器：制冰机；液氮&研钵/生物样品研磨仪；高速离心机；移液器（1ml、200μl、100μl/50μl）；涡旋振荡仪；恒温金属浴。相关耗材：解剖工具，冰盒，离心管，离心管架，吸头（1ml，200μl/300μl），一次性手套，实验手套。实验步骤1.取暂养草鱼，冰上放置一段时间，然后解剖，剪取肠道50~100mg，放入研钵中，加入液氮迅速研磨，然后加入1ml预冷TRIzol试剂，充分研磨至无颗粒物存

2、在。2.转移到离心管中，室温放置5min，使细胞充分裂解；3.按1mlTrizol加入200μl氯仿，盖上盖子，迅速充分摇匀15s，然后室温放置3min；4.4℃，,12000g离心15min；此时混合物分为三层，下层红色的苯酚氯仿层，中间层和上层无色水相；RNA存在于无色水相中；5.小心吸取上清液，千万不要吸取中间界面，否则有DNA污染；转移至一个新的离心管，加入等体积的异丙醇，轻轻混匀；6.室温放置10min；4℃，,12000g离心10min；7.弃上清，加入1ml75%乙醇洗涤；涡旋，悬浮沉

3、淀；4℃，,12000g离心5min；8.弃上清；可以再次用75%乙醇洗涤沉淀；9.弃上清；用移液器轻轻吸取管壁或管底的残余乙醇，注意不要吸取沉淀；室温放置5min晾干沉淀；（RNA样品不要过于干燥，否则极难溶解）10.沉淀中加入30μlRNase-free水，轻弹管壁，使RNA溶解。uRNA质量检测相关试剂：溴酚蓝，TEB/TAE电泳缓冲液，溴乙锭（EB）相关仪器：（超微量分光光度计，移液器（2.5μl或2μl规格，10μl规格），电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，制冰机）相关耗材：（

4、无菌无绒纸，吸头，离心管架，PCR管，PCR管架，锥形瓶，烧杯，一次性手套，实验手套，冰盒）（1）RNA纯度的检测：测定其OD260和OD280的值，根据其OD260/OD280的比值，当其比值在1.9~2.1之间，说明提取的总RNA纯度比较高，没有蛋白质和基因组的污染。（2）RNA完整性的检测：取2μlRNA，与2μl溴酚蓝混匀，用1%的琼脂糖进行凝胶电泳，20min后，在凝胶成像系统中观察效果。当28S与18S条带清晰，且亮度比大约是2:1时，5S条带若隐若现，而且没有其它条带时，说明完整性不错

5、，可以用于下游逆转录实验。一、逆转录（RNA逆转录成cDNA）相关仪器：（PCR仪/恒温金属浴，移液器（2.5μl或2μl规格，10μl规格），100μl冰盒，制冰机，PCR管）根据逆转录试剂盒（TOYOBO公司）说明书进行，反应体系及条件如下：试剂使用量（μl）RnaseFreeH2O11.75-YOligo（dT）1TotalRNA（<1000ng）YTotalVolume12.7565℃，5min后，立即置于冰上。试剂使用量（μl）上一步变性后RNA溶液12.755×RTBuffer4dNTP

6、Mixture（各10mM）2RnaseInhibitor（10U/μl）0.25ReverTraAce1TotalVolume20然后放置于PCR仪上，反应程序为：42℃,60min；99℃,5min；16℃,5min。所得cDNA放置于-20℃保存。二、PCR反应相关仪器：（PCR仪/恒温金属浴，移液器（2.5μl或2μl规格，10μl规格），100μl电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，冰盒，制冰机）试剂使用量（μl）ddH2O6.0反转录产物1.010×PCRBuffer1.0dN

7、TP（10mmol/l）0.2Taq酶（1U/μl）0.4Ghrelin-F（10μmol/l）0.4Ghrelin-R（10μmol/l）0.4MgCl2（25mmol/l）0.6TotalVolume10反应条件：95℃,预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸10min。反应结束后，取5μlPCR产物，1%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物的分离，回收和纯化相关试剂：胶回收试剂盒相关仪器：（紫外照胶仪，移液器（200μl，1ml规格），离心机，

8、恒温金属浴，涡旋混匀仪，制冰机，超微量分光光度计）相关耗材：（切胶刀片，吸头，离心管架）PCR反应得到目的条带后，加大反应体积，然后根据胶回收试剂盒说明书进行目的片段的回收纯化。将所得DNA贮存于-20℃。一、目的片段与载体的连接相关仪器：（恒温金属浴，移液器（10μl，2.5μl规格）涡旋混匀仪，制冰机）按照连接试剂盒(TAKARA公司)说明书进行操作。pMD-18T载体1μlDNA2μlddH2O2μl然后加入5μlLigationMix，4℃/16℃放置过夜连接