里氏木霉纤维二糖水解酶基因cbh1的分子改造.pdf

《里氏木霉纤维二糖水解酶基因cbh1的分子改造.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、南方农业学报JournalofSouthemAgriculture2014．45(10)：1739—1743ISSN2095—1191：CODENNNXAABhttp：／／www．nfnyxb．caDOI：10．3969／j：issn．2095—1191．2014．10．1739里氏木霉纤维二糖水解酶基因cbhl的分子改造陈小玲1，张穗生1，黄俊1，雷富2，陈东卜(1广西科学院非粮生物质酶解国家重点实验室／国家非粮生物质能源工程技术研究中心／广西生物质炼制重点实验室，南宁530007；2广西科学院广西近海海洋环境科学重点实验室，南宁530007)摘要：【目的】用分子改造的方法改造里氏木霉(Tf

2、ichodermareesei)的纤维二糖水解酶基因cbhl，提高其纤维素酶活力，为工业化生产纤维素酶提供参考。【方法】用DNaseI消化里氏木霉cbhl，回收100bp左右的片段后用T4DNA连接酶连接，以连接产物作为模板进行PCR扩增，将PCR改造的cbhl基因转化里氏木霉原生质体，使改造的cbhl基因与里氏木霉原有的cbhl基因发生同源重组。通过比较滤纸酶活力的方法筛选纤维素酶活力提高的突变菌株，在NCBI上比对分析突变菌株的cbhl序列。【结果】经克隆测序获得基因片段大小为637bp，与里氏木霉同属菌株cbhl基因的相似性在880／一98％，确定为里氏木霉cbhl的基因片段。经DNas

3、eI消化15min、T4DNA连接酶连接、经PCR扩增获得改造后的cbhI基因。将改造cbhl基因片段转化里氏木霉原生质体，得到cbhl基因突变体库。从cbhl基因突变体库中筛选获得1株纤维素酶滤纸酶活比出发菌株高1．7518倍的突变菌株E2．。。序列比对分析发现，与出发菌株相比，突变菌株巨。的cbhl基因有14个碱基发生了突变，其中5个碱基为置换突变，8个碱基为缺失突变，1个碱基为插入突变，分布于cbhl基因的9个位置。【结论】改造后的cbh硅因能与里氏木霉的染色体DNA发生同源重组，进而提高突变菌株的纤维素滤纸酶活力。关键词：里氏木霉；纤维素酶；纤维二糖水解酶基因；分子改造；碱基突变中图分

4、类号：Q785文献标志码：A文章编号：2095—1191(2014)10—1739—05MolecularmodificationofceUobiohydrolasegenecbhlfromTrichodermareeseiCHENXiao—ling1，ZHANGSui—sheng1，HUANGJunl，LEIFu2，CHENDong1+(1StateKeyLaboratoryofNon-FoodBiomassandEnzymeTechnology，GuangxiAcademyofScience／NationalEngineeringResearchCenterforNon-FoodBiore

5、finery／GuangxiKeyLaboratoryofBiorefinery，Nanning530007，China；2GuangxiKeyLaboratoryofMarineEnvironmentalScience，GuangxiAcademyofSciences，Nanning530007，China)Abstract：【Objective】MolecularmodificationofcellobiohydmlasegenecbhlfromrreeseiWaScarriedouttoim—provecellulaseactivityinordertoprovidescientific

6、refereneeforeommercialproductionofeellulase．【Method】Cel—lobiohydrolasegenecbhIfromrreeseiwasdigestedwithDNaseI．andtherecycledfragmentsabout100bpwerelinkedwithT4DNAligaserandomly．Byusingtheconnectionproductastemplates，thecbhlsequencewasamplifiedbyPCRmethod．ThemodifiedebbJgenewastransferredintorreesei

7、protoplasttoconducthomologousrecombina—tionwithoriginalcbhJ．MutantstrainswithhighcellulaseactivitywerescreenedbasedonfilterPaDerenzymeactivity．cbhlgenesequencealignmentwasperformedintheNCBI．【Result】r1