伪狂犬抗体检测.ppt

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1、实验六、伪狂犬抗体检测（阻断ELISA)一、实验目的了解伪狂犬的抗体检测方法；掌握ELISA的原理和类型；掌握阻断ELISA检测方法的操作程序。二、实验原理抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，并保持其免疫学活性；抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在。单抗血清？底物显色阻断ELISA酶标板，酶标仪包被缓冲液：0.025MpH9.6碳酸盐缓冲液猪伪狂犬病毒（PRV）——抗原样品稀释液：pH7.4PBS三、实验材料阴性

2、对照（EP管中，已稀释）阳性对照（EP管中，已稀释）样品——待测猪血清（EP管中，已稀释）HRP标记猪PRV单抗——酶标单抗（EP管中，已稀释）洗涤液：含0.05%Tween20的0.01MpH7.4PBS（青瓶）常用酶及底物常用酶底物加终止液前颜色加终止液后颜色碱性磷酸酶（AP）邻苯二胺（OPD）橙黄色棕黄色辣根过氧化物酶（HRP）四甲基联苯胺（TMB）蓝色蓝色底物缓冲液：pH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液底物溶液：TMB（四甲基联苯胺），底物缓冲液，30%H2O2，新鲜配制终止液1.抗原的处理：2.包被抗原：取酶标板，加入100μL/孔的抗原稀释液4℃

3、，18h取出包被好抗原的酶标板（4孔/组），甩干孔内液体以洗涤液（200μL/孔）洗涤3次，3min/次四、实验方法3.加待测血清：标记各孔，加入相应液体100μL/孔1234阴性待测阳性待测4.加酶标单抗：37℃，30min甩干孔内液体以洗涤液（200μL/孔）洗涤3次，3min/次各孔加入酶标单抗100μL/孔37℃，30min5.显色：甩干孔内液体以洗涤液（200μL/孔）洗涤3次，3min/次加入底物液A和B各一滴（约50μl）避光显色10min，加终止液一滴6.观察结果取稀释好的被检血清2份和阴、阳性对照血清，每孔加入100μl，置37℃温

4、育30分钟。洗板：甩掉板孔中的溶液，每孔加入稀释好的洗涤液200μl，静置3分钟倒掉，再在吸水纸上拍干，重复3次。每孔加酶标单抗100μl，置37℃温育30分钟。洗板：同步骤2。显色与终止：每孔先加底物A液、再B液各1滴(50μl)，混匀，室温（18-25℃）避光显色10分钟后。终止：每孔加终止液1滴(50μl)（0.25%氢氟酸），终止反应。10分钟内测定结果。采用波长630nm的酶标仪测定OD值。结果判定：试验成立的条件是：阴性对照孔平均OD630值与阳性对照孔平均OD630值之差≥0.3。S=样品孔OD630值，N=阴性对照孔OD630值如果S

5、/N比值≤0.35，样品判定为PRV抗体阳性。如果S/N比值≤0.4但>0.35，样品重测。如果S/N比值>0.4，样品判定为PRV抗体阴性。五、结果与分析阴阳性对照样品的OD630＝?S/N＝?，被检血清是阴/阳性？结果与预期的不符，可能的原因是什么？预期结果阳性：无色阴性：蓝色1234阳性阳性阴性被检血清？底物显色被检？？单抗ELISA实验前血清样品尽量做到56℃灭活30分钟。在ELISA的整个操作过程中，洗涤是非常重要步骤，目的在于防止重叠引起非特异性吸附，洗涤时尽可能除去未结合的抗原及杂质，用力甩干。加入底物液后应室温避光，结果判断须在10分

6、钟内。实验中保持安定，不要随意走动、讨论不相关的事情。六、注意事项显色间接ELISA酶联免疫吸附试验(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)将已知的抗原或抗体吸附在固相载体(聚苯乙烯微量反应板)表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在。间接法（IndirectELISA）阻断法（BlockELISA)双抗体夹心法（SandwichELISA)竞争法（CompetitiveELISA)（1）间接法测定抗体A.将抗原吸附于固相载体表面；B.加抗体,形成抗原-抗体复合

7、物;C.加酶标抗体；D.加底物。测定底物的降解量＝抗体量。（2）阻断法测定抗体A.将抗原吸附在固相载体表面;B.先加待检血清（抗体）,形成抗原-抗体复合物;C.再加酶标单抗；D.加底物。（3）双抗体夹心法测定抗原A.将抗体吸附于固相表面;B.加待检抗原，形成抗原-抗体复合物;C.加酶标抗体;E.加底物。底物的降解量＝抗原量。（4）竞争法测定抗原A.抗体吸附在固相载体表面;B.同时加入酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体；对照只加入酶标抗原；C.加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差＝未知抗原量。思考题间接ELISA和阻断ELISA有什么异同？哪种方法要好一

8、些，为什么?伪狂犬的抗体检测方法有哪些？原理是什么？