传染病实验-伪狂犬抗体检测-修改版.ppt

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1、实验七伪狂犬病毒的抗体检测（阻断ELISA)伪狂犬病病毒（PRV）属于疱疹病毒科，α疱疹病毒亚科，猪疱疹病毒I型基因组为线状双股DNA。猪伪狂犬病（Porcinepseudorabies）由伪狂犬病毒引起的家畜和多种野生动物的急性传染病。猪是其贮存宿主和传染源。新生仔猪表现神经症状，还可侵害消化系统。成年猪常为隐性感染。妊娠母猪感染后可引起流产、死胎及呼吸系统症状，无奇痒。公猪表现为繁殖障碍和呼吸系统症状。牛、羊、猫、犬、许多野生动物、肉食动物及野生啮齿类等动物发病后通常具有发热、奇痒及脑脊髓炎等典型症状，均为致死性感染，但呈散发形式。人对伪狂犬病毒无易感性

2、。死胎和木乃伊胎仔猪神经症状仔猪的瘙痒新生仔猪大量死亡病猪呈抽搐症状，角弓反张病猪精神萎靡，背毛粗糙，生长不良及消瘦，严重者有明显呼吸症状一、实验目的了解伪狂犬的抗体检测方法；掌握ELISA的原理和类型；掌握阻断ELISA检测方法的操作程序。伪狂犬的抗体检测-阻断ELISA法二、实验原理抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，并保持其免疫学活性；抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在。显色间接ELISA单抗血清？底物显色阻断ELI

3、SA三、实验材料酶标板，酶标仪包被缓冲液：0.025MpH9.6碳酸盐缓冲液猪伪狂犬病毒（PRV）——抗原样品稀释液：pH7.4PBS阴性对照（1:1稀释）阳性对照（1:1稀释）样品——待测猪血清（1:1稀释）HRP标记猪PRV单抗——酶标单抗洗涤液：含0.05%Tween20的0.01MpH7.4PBS底物缓冲液：pH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液底物溶液：TMB（四甲基联苯胺），底物缓冲液，30%H2O2，新鲜配制终止液：0.25%氢氟酸常用酶及底物常用酶底物加终止液前颜色加终止液后颜色碱性磷酸酶（AP）邻苯二胺（OPD）橙黄色棕黄色辣根过氧化物酶（HRP）四甲

4、基联苯胺（TMB）蓝色蓝色1.抗原的包被（物理吸附）2.待测样品和对照血清的稀释取酶标板，加入100μL/孔的稀释抗原液4℃，18h取出包被好抗原的酶标板，甩干孔内液体以洗涤液（200μL/孔）洗涤3次，3min/次四、实验方法3.加待测血清：加入待测血清和对照血清100μL/孔1234阴性待测阳性待测4.加酶标单抗：37℃，30min甩干孔内液体以洗涤液（200μL/孔）洗涤3次，3min/次各孔加入酶标单抗100μL/孔37℃，30min5.显色：甩干孔内液体以洗涤液（200μL/孔）洗涤3次，3min/次加入底物液A和B各一滴（约50μL）室温避光显色1

5、0min，加终止液一滴（约50μL）6.观察结果10min判定结果，采用630nm波长的酶标仪测定OD值取稀释好的被检血清2份和阴、阳性对照血清，每孔加入100μl，置37℃温育30分钟。洗板：甩掉板孔中的溶液，每孔加入稀释好的洗涤液200μl，静置3分钟倒掉，再在吸水纸上拍干，重复3次。每孔加酶标单抗100μl，置37℃温育30分钟。洗板：同步骤2。显色与终止：每孔先加底物A液、再B液各1滴(50μl)，混匀，室温（18-25℃）避光显色10分钟后。终止：每孔加终止液1滴(50μl)（0.25%氢氟酸），终止反应。10分钟内测定结果。采用波长630nm的酶标

6、仪测定OD值。结果判定：试验成立的条件是：阴性对照孔平均OD630值与阳性对照孔平均OD630值之差≥0.4。S=样品孔OD630值，N=阴性对照孔OD630值如果S/N比值≤0.6，样品判定为PRV抗体阳性。如果0.6＜S/N比值≤0.7，样品可疑，需要重测，若结果相同判为阳性。如果S/N比值>0.7，样品判定为PRV抗体阴性。五、结果与分析阴阳性对照样品的OD630＝?S/N＝?，被检血清是阴/阳性？结果与预期的不符，可能的原因是什么？预期结果阳性：无色阴性：蓝色1234阳性阴性被检血清？底物显色被检？？单抗单抗不显色，结果阳性显色，结果阴性六、注意事项试

7、剂盒使用前各试剂应平衡至室温，使用完毕放回4℃保存。待检血清样品数量较多时，应先稀释完所有待检血清，再加到抗原包被板上，使反应时间一致。在ELISA的整个操作过程中，洗涤是非常重要步骤，目的在于防止重叠引起非特异性吸附，洗涤时尽可能除去未结合的抗原及杂质，用力甩干。底物液和终止液不能暴露于强光或接触氧化剂。加入底物液后应室温避光，结果判断须在10分钟内。酶联免疫吸附试验(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)将已知的抗原或抗体吸附在固相载体(聚苯乙烯微量反应板)表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，根据加入底物的颜色

8、反应来判定是否有免疫反应的存在。ELI