高效液相色谱-串联质谱及特异性抑制剂探针方法研究异嗪皮啶的体外CYP450代谢产物及代谢亚型.pdf

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1、第41卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第9期2013年9月ChineseJournalofAnalyticalChemistry1391—1395DOI：10．3724／SP．J．1096．2013．21322高效液相色谱-串联质谱及特异性抑制剂探针方法研究异嗪皮啶的体外CYP450代谢产物及代谢亚型毕云枫'朱洪彬郑重刘志强宋凤瑞(吉林农业大学，食品科学与工程学院，长春130118)(中国科学院长春应用化学研究所，长春质谱中心，长春130022)摘要利用高效液相色谱-串联质谱及特异性抑制剂探针方法研究了异嗪皮啶在大鼠肝微粒体CY

2、P450中的代谢产物及代谢亚型。结果表明，异嗪皮啶在大鼠肝微粒体的代谢时间为2h最佳，其主要代谢产物有5种。CYP3A，CYP2C，CYP2El等亚型为异嗪皮啶在大鼠肝微粒体内的主要代谢酶。本方法为进一步研究药物一药物相互作用提供了依据。关键词异嗪皮啶；细胞色素P450；代谢；高效液相色谱一串联质谱；特异性抑制剂探针1引言异嗪皮啶是一种香豆素类化合物，是刺五加及草珊瑚、肿节凤等中药的主要活性成分之一，具有很好的抗癌、抗疲劳、抗应激、免疫调节、利胆、抗菌、抗氧化等作用“J。临床应用于清热凉血、活血化瘀、消肿止痛、抗菌消炎等诸多方面，其结构式如

3、图1所示。目前以异嗪皮啶为指标性成分对相关中药及方剂进行质量控制的文献较多，而针对异嗪皮啶的代谢研究的较少。肝脏是药物代谢的主要器官，细胞色素P450酶系(CYP450)是肝脏大部分药物代谢最主要的I相反应酶，也是人体内最重要的代谢酶。在肝微粒体中，CYP450药物代谢多受CYP3A4，2C19，2C9，2D6和1A2的催化，也有少部分由2B6，2C8，1A1，2A6，2El，2B1和2C10催化J。药物的肝脏内代谢是药物体内过程的重要环节，通过药物代谢的研究可以阐明药物的代谢途径及参与药物生物转化的酶，进而对相关药物在人体内的代谢规律及特

4、征进行预测，确定可能影响药物性质的理化因素及可能发生的药．药相互作用，为新药的研发和药物临床应用的安全性提供依据。近年来，随着CYP450在药物代谢领域的广泛应用，越来越多的研究者将目光转到了中药成分的CYP450代谢方面。。’。本研究采用高效液相色谱一串联质谱方法对异嗪皮啶在大鼠肝微粒体中的主要代谢产物进行了研究，根据串联质谱数据鉴定出5种代谢产物，并确定了其代谢途径。此外，采用特异性抑制剂探针及LC-MS／MS方法，确定了异嗪皮啶主要的大鼠CYP450代谢亚型酶。2实验部分2．1仪器、试剂及实验动物FinniganLTQXL离子阱质谱仪

5、，AccelaU-HPLC超高效液相色谱系统(美国Thermo公司产品)；DiamonsilCl8色谱柱(250inln×4．6mln，5Ixm)；SanoriusBSll0S分析天平(北京赛多利斯有限公司产品)；OptimaL．100xP制备型超速离心机(贝克曼库尔特实验系统(苏州)有限公司)；DY89．Ⅱ型电动玻璃匀浆机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；Eppendorf5810R台式高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)。磺胺苯吡唑、．萘黄酮、二乙基二硫代氨基甲酸铵、奥美拉唑、葡萄糖-6．磷酸、葡糖_6一磷酸脱氢酶、-NADP(

6、Sigma公司)；奎那定、酮康唑、8一甲氧基补骨脂素(日本TCI公司)。甲醇、乙腈(色谱纯，美国Fisher公司)；异嗪皮啶标准品(中国药品生物制品检定所)。水为二次去离子水。清洁级雄性SD大鼠，体重(220~20)g，由吉林大学实验动物中心提供，合格证号：(吉)2O08-OO05。2012—12_28收稿；2013-04~8接受本文系国家自然科学基金(No．81073040)项目及国家博士后基金项目(No．2011M500625)资助E—mail：songfr@elae．ae．en分析化学第41卷2．2肝微粒体制备雄性sD大鼠，保持12h

7、明暗交替，在实验环境下适应5d以上。实验前动物禁食24h，将所用器具、试剂置于4℃预冷。动物脱臼处死，迅速剪开心脏，用注射器以4o【=生理盐水由门静脉灌洗，灌洗至肝脏呈土黄色。将肝脏剪碎，按1：4(w／V)加人TMS缓冲液(pH7．5)，冰浴中匀浆。再超声分散30S。4℃下20000g离心20rain；取上清液再以105000g离心60min，弃上清液，沉淀部分即微粒体。按初始匀浆时每克肝组织加入1mL含有20％甘油的Tris．HC1储存液(pH7．5)，重悬微粒体，冰浴，玻璃匀浆管手动研磨，使微粒体均匀分散。分装微粒体。_80qc保存。以

8、小牛血清白蛋白为标准品采用Lowry法测定微粒体蛋白含量。2．3微粒体孵育反应体系及代谢反应时间的确定200L酶反应体系[93，由100mmoL／L磷酸盐缓冲液(pH7．4)，0