高分辨飞行时间质谱在蛋白质组学相对定量分析中的应用.pdf

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1、第44卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第3期2016年3月ChineseJournalofAnalyticalChemistry403—408DOI：10．11895／j．issn．0253-3820．150751高分辨飞行时间质谱在蛋白质组学相对定量分析中的应用洪晓愉王浩徐金玲李水明王勇(深圳大学生命科学学院，微生物工程重点实验室，深圳518060)(深圳大学生命与海洋科学学院，深圳市海洋生物资源与生态环境重点实验室，深圳518060)摘要利用TripleTOF5600高分辨质谱仪分析牛血清白蛋白等3种蛋白质标准品，研

2、究了质谱离子强度与蛋白质样品相对含量的相关性。蛋白质标准品用胰酶酶切后，稀释成l一1024fmol／7I．LL的系列溶液，考察在1～1024fmol上样量情况下，肽段的前体离子计数(cps)、蛋白质全部肽段的离子计数之和以及被检出肽段数目与上样量的相关性，以及相同样品在3次平行实验之间这些数值的变化幅度。结果表明。被检出肽段数目与上样量正相关，当cps超过1000时，所有肽段离子强度之和与上样量呈线性关系，但是用最灵敏肽段的离子强度表示更为准确。3次测量同一肽段的最高离子强度通常不会超过最低强度的1．5倍，提示当不同样品中同一蛋白的

3、离子强度相差3倍以上是判断不同样品中相同蛋白质的含量具有差异的可靠阈值。本研究提供了一种利用高分辨率和高扫描速度蛋白质组组学定性数据进行半定量分析的方法，简便、快速，可为相关生物学和医学研究提供参考。关键词定量蛋白质组学；高分辨飞行时间质谱；打击计数；信号强度；无标记定量1引言了解特定生物学过程，不仅要知道所涉及的分子种类，还需要明晰它们的含量及动态变化。具有高通量、高灵敏度、高线性范围和较高准确度的定量蛋白质组学近年来发展迅速，在生物学和医学研究中的应用日益广泛“]。按照不同的定量原理，定量蛋白质组学技术可分为依据凝胶成像和液相色

4、谱一质谱信号强度两种定量技术。前者主要利用双向电泳(银染或考染)或双向荧光差异凝胶电泳(DIGE)Is]，在蛋白质水平上进行定量分析，蛋白质的定量和序列鉴定是两个独立的步骤，其优点是差异蛋白被真正分离，并且更为直观，但是操作繁琐耗时，各种翻译后修饰的存在使得“单一”蛋白点上有可能是分子量和等电点非常接近的蛋白质的混合物。随着多维液相色谱．质谱技术和数据处理软件的不断发展，基于质谱的定量蛋白质组学技术逐渐成为该领域的主流技术。基于质谱的定量分析是将蛋白质通过特异性酶切水解成适于质谱检测的肽段，在进行肽段序列鉴定的同时提取质谱信号的强度

5、信息，然后将来自肽段的定量信息还原成蛋白质的定量信息。根据定量分析目的，又分为以三重四级杆质谱为平台的绝对定量分析(SRM)和在其它串联质谱上实现的相对定量分析。绝对定量分析是对已知蛋白和肽段的靶向测定，灵敏度高，抗干扰性强，但通量较小并需要合成目标肽段。目前应用更为广的方法是在高分辨质谱上同时实现蛋白质的鉴定和定量分析，按照定量分析策略，后者又可分为稳定同位素标记定量分析和无标记定量分析两类¨J。典型的标记定量分析方法有两种：需要含同位素标记的细胞培养基(SILAC)和需要增加蛋白质处理步骤的iTRAQ¨方法，虽然成本较高，但由于

6、其稳定性和准确性较高，目前被许多研究者在发现蛋白质组学中所采用。非标定量分析方法包括信号强度法和谱图计数法，其在实验操作上与定性分析相似，但要求复杂的数据提取和处理方法，并且每个样品需至少平行测定3次，以消除各种偶然误差，耗时较长。SILAC和iTRAQ分别根据一级和二级质谱信号进行定量分析。近年来，根据三级串联质谱信号定量分析和各种非数据依赖型采集方法的发展很快¨。2015-09—22收稿；2015—12—12接受本文系深圳市科技项目(Nos．JSGG20140703163838793，20150006)资助E—mail：wyon

7、g@SZU．edu．cn分析化学第44卷但是，在一些生物学项目中，研究者也希望根据单次的蛋白质组学定性实验结果，得到某些目标蛋白含量的粗略比较，为下一步实验提供研究方向和决定是否进行定量分析蛋白质组学分析。因此，如果在蛋白质组的定性鉴定实验中提取出半定量分析信息，将有助于满足这样的实验需求。在Protein—pilot搜库软件输出的肽段汇总列表中，除肽段序列、误差和保留时间等指标外，还包括前体离子强度的信息，即总打击计数(counts)，它是通过对色谱峰上所有采样点的数据求和所得。为便于不同实验条件的比较，该值以每秒打击计数(eps

8、)的形式表示，如果该离子被多次扫描，在删除重复项之后，系统会留下最高值。无标记定量分析中通常采用色谱峰的峰面积定量分析，但需要对每个肽段逐一进行提取，而利用cps的优势在于该值可自动输出，方便快捷。用该值近似表示肽段含量涉及以下问题：