质谱在蛋白质中的应用课件.ppt

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1、质谱在蛋白质中的应用周小雪2013342020质谱在蛋白质中的应用待研究生物体系中表达的蛋白质经过凝胶电泳（或高效液相色谱及毛细管电泳）分离后，从中提取出感兴趣的蛋白点，然后经过蛋白酶水解成为小肽片断，分离后应用质谱（电喷雾质谱、基质辅助激光诱导解吸质谱）；然后研究某一小肽片断的序列，并重复此步骤得到多个片断序列，输入数据库即可获知此为哪一蛋白质。明确了蛋白质归属后，可以研究此蛋白质随生物体系环境变化的变化情况，从而了解此蛋白质在生物体中的功能。在这个过程中，蛋白质的水解及肽的质谱序列研究起着很重要的作用。蛋白质

2、组学研究中个典型研究流程蛋白质研究中个典型研究流程质谱分析蛋白优点：1.可用于分析大分子。2.可用于分析不纯化合物。因为生物体系相对较复杂，物质提纯不易，因此新型质谱的出现使一些研究成为可能。3.样品消耗量很低。4.仪器操作简便，检测速度快，适用于大批量的样品研究。现代质谱简介原理：样品溶液通过一根毛细管进入雾化室雾化，形成带有多电荷的液滴，仪器的电离源处于高真空状态，液滴进入时溶剂挥发，液滴的体积变小，表面的电荷密度增大。由于同性电荷的相互排斥，溶液中样品的分子就以离子的形式逸出。蛋白（肽），都是高度亲水性分子，

3、高温下易分解，因而电喷雾这种电离方式非常适用于这类分子的研究。电喷雾电离（ESI-MS）电喷雾电离（ESI-MS）多级质谱分析是鉴定化合物结构的一种十分重要的方法，该法可直接用于混合物分析，将混合物的质谱中某一质荷比的峰分离出来进行串联质谱分析，就有可能确认它的结构。这样就能省去大量的分离、纯化工作。目前用于多级质谱分析的质量分析器主要有串联四极杆和离子阱两种。基质辅助激光诱导解吸质谱（MALDI-MS）方法：将被分析物质（umol/L级的浓度）的溶液和某种基质（mmol/L级的浓度）溶液相混合;蒸发溶剂，被分析物

4、质与基质成为晶体或半晶体；用一定波长的脉冲式激光照射。基质分子为可吸收激光光能物质，从而获取能量，使基质分子和样品雾化进入气相并得到电离。优点1.使难于电离的样品电离，且无明显碎裂，得到完整的被分析物分子的电离产物，特别是在肽类化合物研究中取得很大成功；2.由于应用的是脉冲式激光，适合于与飞行时间质谱计（TOF）相连，从而使检测在原理上不受待测分析物分子质量的限制，即分子质量可无限大；MALDI-TOF结构示意图质谱在蛋白质研究中的主要作用在于检测确定相应蛋白质的归属，其中测定小肽及蛋白质序列是确定蛋白质的根本。质

5、谱用于肽和蛋白质的序列测定方法有3种。主要如下：质谱在小肽与蛋白质序列测定中的应用第一种方法叫蛋白图谱（proteinmapping),用特异性的酶解或化学水解的方法将蛋白切成小的片段，然后用质谱检测各产物肽分子质量，将所得到的肽谱数据输入数据库，搜索与之相对应的已知蛋白，从而获取待测蛋白序列.第二种方法是利用待测分子在电离及飞行过程中产生的亚稳离子，通过分析相邻同种类型峰的质量差，识别相应的氨基酸残基.第三种方法与Edman法有相似之处，即用化学探针或酶解使蛋白质或肽从N端或C端逐一降解下氨基酸残基，形成相互间差

6、一个氨基酸残基的系列肽，名为梯状测序（Laddingsequencing)，经质谱检测，由相邻峰的质量差知道相应氨基酸残基。质谱用于肽和蛋白质的序列测定方法质谱中常见氨基酸残基的元素组成和质量数待测离子经活化后具有较高的能量，诱发碎裂，产生多组不同类型的碎片峰。所以首先需要区分出各组峰的类型归属，才能通过比较相邻的同种离子的质量差，判断相应的氨基酸残基.质谱中常见氨基酸残基的元素组成和质量数见下表。质谱质谱中氨基酸残基的元素组成和精确质量数中常见氨基酸残基的元素组成和质量数质谱在蛋白质研究中的其他应用除了前面介绍的

7、肽与蛋白质序列测定以外，还包括质谱与其他分离手段连接（如与毛细管电泳、HPLC相连等）以加快测样速、度，提高质谱检测精度（如使用傅立叶回旋分析器与ESI和MALDI相连等。其中有一项工作是非常重要的，即蛋白质的定量蛋白质的定量这方面的工作进行得非常多，而且也获得了很大的成功。这其中最成功也最巧妙的是Gygi等人于1999年发明的一种新的蛋白质定量方法：他们合成了一种新的化合物，其上连有与Avidine蛋白特异性结合的的化合物Biotin（用于纯化），碘（用于与蛋白半胱氨酸上巯基反应使化合物结合到某些小肽片段）。通过

8、用氘代氢替换中间烷基链上的氢原子，可合成两种物化性质相同而分子质量相差8u的化合物（分别为重链和轻链）。将两个须比较的细胞体系中的蛋白质分离后分别与重链和轻链反应，使以上化合物结合到蛋白上的半胱氨酸残基位点。然后将两个体系合并，用蛋白酶降解。酶解产物通过固定有Avidine蛋白的亲和柱分离去除多余片段。用质谱分析分离产物，用多级质谱确定每一肽片段来源，对比各