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1、第七节细胞培养污染的检验9去除一、细菌与霉菌的污染曲于环境条件差和操作不当等原因，常可发生细菌和壽菌的污染。常见污染的细菌有革兰阴性菌如：人肠埃希菌、枯草杆菌、假单胞菌等；革兰阳性菌有荷萄球菌等，真菌污染常可发生，尤其炎热、潮湿的季节十分常见，如烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、砲子苗等。霉菌和细菌生长迅速，能在短时间内抑制细胞生长，或产生有意物质杀死细胞。镜下可见脑浆内出现人量颗粒，细胞变圆或崩溃，从瓶壁脱落。希菌污染容易发现，人多形成白色或浅黄色菌团漂浮于培养液表面，肉眼可见，有的散在生长，镜下可见丝状菌丝，纵横交错于细胞之间。细菌污染如果较严重时培养基上清混浊，较轻时镜下可见
2、小的菌体在细胞间运动，同时可涂片染色镜检或进行细菌培养基培养，加以确定。抗生案及抗霉菌制剂对预防或排除细菌、霉苗污染均有效。工作中要特别注意和防I匕所用培养液和血清的污染，H前应仔细检查有无混浊和菌丝存在，以防止在培养细胞时造成污染。二、支原体污染的检测与去除（一）支原体的检测1.pcre*原理该法是通过PCR技术将支原体16srRNA棊因特异性扩增，來检测培养细胞中污染的支原体。PCR引物选白16srRNAS因上的支原体特异片段，此片段与其他细菌的序列无交叉性杂交反应。扩增产物用琼脂糖凝胶电泳，经混乙噪（EB）染色后在紫外透射仪上进行检测。16srDNA引物用水稀释至4
3、0umol/U（1）.正向引物：5,-ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTA-3*（2）.反向引物：5,-TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC-3,质粒pBR322引物用水稀释至40umol/L.（1）.正向引物：5,-CATCTCGGGCAGCGTTGGGT-3*（2）.反向引物：5'-AGCGCAAGCGGAGTGAGTGAGC-3?裂解缓冲液：10mmol/LTris-HCL（pH8.3）,50mmol/LKCL,2.5mmol/LMgcl2,5g/LTween20和5g/LTritonX-100o蛋白酶K（proteinaseK）贮存液：蛋
4、白酶K20mg/ml溶于50%甘油中，于・200C贮存。耐热DNA聚合酶（如"feq聚合酶）与相应的10XTAE缓冲液（见附录A1）琼脂糖（分子生物学级）；渙乙噪（10mg/ml溶于水中并避光保存）。6X加样染液（40%甘油、0.125%漠酚蓝和125mmol/LEDTA）.DNA分子量标志（50ng/ml）、pBR322DNA。DNA扩增仪、台式离心机、微波炉、电泳装置、紫外透射仪（UV）、加样枪、PCR管（0.5ml或0.2ml）。方法与步骤1）样品制备（1）将106细胞悬液或贴壁细胞刮下来的悬液放1.5ml微离心管内，以最人转速离心15mino（2）奔去上清，将细胞
5、再悬浮T100ul裂解液中，然后加蛋白酶K,使终浓度为60ug/mL（3）置微波炉内600。脖育1h,然后升至950C10min,再将样品置室温中降温。2）PCR扩增（1）在冰浴中对各样品制备PCR重要混合物，对每个样品均加入：10XPCR缓冲液5.0ml25mmol/LdNTPs混合物0.4ul40umol/L16srDNA引物每种引物1.0ul40umol/LpBR322DNA引物每种2.0ulpBR322DNA1pg/ml2.0ulDNA聚合酚（5U/ml）0.2ul三蒸水35.4ul总量45ul（2）用无菌去离子水稀释样品为1:10,1:100o（3）于每个epp
6、endorf管中加45ulPCR扩增混合物,每管中分别加入样品原液及1:10,1:100稀科液备5ul,操作均在冰浴中进行。（4）在每个eppendorf管中轻轻加入50ul无菌矿物油，覆盖在液面上。如DNA扩增仪带有有制式热盖，此步骤可省略。（5）将各管放入DNA扩增仪的孔槽内，并执行以下循环指令：%1950C10min一个循环%1950C,30S-580C1min->720C1min,共30个循环。%1最后720C10min延长循环。3）PCR产物分析（1）制备含有EB染料（0.1ug/ml）的1%琼脂糖凝胶（用TAE缓冲液制备）（2）从PCR扩增仪中収出样品管，収1
7、0UIPCR扩增产物加到2』带有染液的加样液中，混匀后加样到琼脂糖凝胶加样孔中，同时在对照孔中加10ul标准DNA分子量标志。（3）凝胶置TAE缓冲液中，电压80V,电泳60-90mino（4）凝胶电泳完毕,将凝胶置紫外透射仪下观察，有无被EB染料着色的红色荧光DNA条带,样品孔与标准DNA孔进行比较并拍照。质控与提示1）阳性对照（1）如来支原体DNA可資到，则10ngDNA即呈阳性结果。（2）如得到已知支原体感染的细胞培养，细胞可同样品一样处理，作为阳性对照，处理的细胞置・200G东存，可重复使用。2）阴性对照（1）用45u
