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1、第七节细胞培养污染的检验9去除一、细菌与霉菌的污染曲于环境条件差和操作不当等原因,常可发生细菌和壽菌的污染。常见污染的细菌有革兰阴性菌如:人肠埃希菌、枯草杆菌、假单胞菌等;革兰阳性菌有荷萄球菌等,真菌污染常可发生,尤其炎热、潮湿的季节十分常见,如烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、砲子苗等。霉菌和细菌生长迅速,能在短时间内抑制细胞生长,或产生有意物质杀死细胞。镜下可见脑浆内出现人量颗粒,细胞变圆或崩溃,从瓶壁脱落。希菌污染容易发现,人多形成白色或浅黄色菌团漂浮于培养液表面,肉眼可见,有的散在生长,镜下可见丝状菌丝,纵横交错于细胞之间。细菌污染如果较严重时培养基上清混浊,较轻时镜下可见
2、小的菌体在细胞间运动,同时可涂片染色镜检或进行细菌培养基培养,加以确定。抗生案及抗霉菌制剂对预防或排除细菌、霉苗污染均有效。工作中要特别注意和防I匕所用培养液和血清的污染,H前应仔细检查有无混浊和菌丝存在,以防止在培养细胞时造成污染。二、支原体污染的检测与去除(一)支原体的检测1.pcre*原理该法是通过PCR技术将支原体16srRNA棊因特异性扩增,來检测培养细胞中污染的支原体。PCR引物选白16srRNAS因上的支原体特异片段,此片段与其他细菌的序列无交叉性杂交反应。扩增产物用琼脂糖凝胶电泳,经混乙噪(EB)染色后在紫外透射仪上进行检测。16srDNA引物用水稀释至4
3、0umol/U(1).正向引物:5,-ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTA-3*(2).反向引物:5,-TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC-3,质粒pBR322引物用水稀释至40umol/L.(1).正向引物:5,-CATCTCGGGCAGCGTTGGGT-3*(2).反向引物:5'-AGCGCAAGCGGAGTGAGTGAGC-3?裂解缓冲液:10mmol/LTris-HCL(pH8.3),50mmol/LKCL,2.5mmol/LMgcl2,5g/LTween20和5g/LTritonX-100o蛋白酶K(proteinaseK)贮存液:蛋
4、白酶K20mg/ml溶于50%甘油中,于・200C贮存。耐热DNA聚合酶(如"feq聚合酶)与相应的10XTAE缓冲液(见附录A1)琼脂糖(分子生物学级);渙乙噪(10mg/ml溶于水中并避光保存)。6X加样染液(40%甘油、0.125%漠酚蓝和125mmol/LEDTA).DNA分子量标志(50ng/ml)、pBR322DNA。DNA扩增仪、台式离心机、微波炉、电泳装置、紫外透射仪(UV)、加样枪、PCR管(0.5ml或0.2ml)。方法与步骤1)样品制备(1)将106细胞悬液或贴壁细胞刮下来的悬液放1.5ml微离心管内,以最人转速离心15mino(2)奔去上清,将细胞
5、再悬浮T100ul裂解液中,然后加蛋白酶K,使终浓度为60ug/mL(3)置微波炉内600。脖育1h,然后升至950C10min,再将样品置室温中降温。2)PCR扩增(1)在冰浴中对各样品制备PCR重要混合物,对每个样品均加入:10XPCR缓冲液5.0ml25mmol/LdNTPs混合物0.4ul40umol/L16srDNA引物每种引物1.0ul40umol/LpBR322DNA引物每种2.0ulpBR322DNA1pg/ml2.0ulDNA聚合酚(5U/ml)0.2ul三蒸水35.4ul总量45ul(2)用无菌去离子水稀释样品为1:10,1:100o(3)于每个epp
6、endorf管中加45ulPCR扩增混合物,每管中分别加入样品原液及1:10,1:100稀科液备5ul,操作均在冰浴中进行。(4)在每个eppendorf管中轻轻加入50ul无菌矿物油,覆盖在液面上。如DNA扩增仪带有有制式热盖,此步骤可省略。(5)将各管放入DNA扩增仪的孔槽内,并执行以下循环指令:%1950C10min一个循环%1950C,30S-580C1min->720C1min,共30个循环。%1最后720C10min延长循环。3)PCR产物分析(1)制备含有EB染料(0.1ug/ml)的1%琼脂糖凝胶(用TAE缓冲液制备)(2)从PCR扩增仪中収出样品管,収1
7、0UIPCR扩增产物加到2』带有染液的加样液中,混匀后加样到琼脂糖凝胶加样孔中,同时在对照孔中加10ul标准DNA分子量标志。(3)凝胶置TAE缓冲液中,电压80V,电泳60-90mino(4)凝胶电泳完毕,将凝胶置紫外透射仪下观察,有无被EB染料着色的红色荧光DNA条带,样品孔与标准DNA孔进行比较并拍照。质控与提示1)阳性对照(1)如来支原体DNA可資到,则10ngDNA即呈阳性结果。(2)如得到已知支原体感染的细胞培养,细胞可同样品一样处理,作为阳性对照,处理的细胞置・200G东存,可重复使用。2)阴性对照(1)用45u