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1、秀丽隐杆线虫的饲养及研究用途By王传杰介绍秀丽隐杆线虫（Caenorhabditiselegans）,属于线形动物门、线虫纲。体形非常小,成虫只有1mm左右。线虫是细胞定数动物，两性成虫只有959个体细胞，雄性成虫只有1031个体细胞，其中131个细胞注定要接一定的发育程序陆续死亡。神经系统解剖结构十分简单，仅有302个细胞，约占整个动物体细胞总数的三分之一。它身体透明,能感知气味和味道,对光线、温度有反应。研究者很容易在显微镜下对其细胞和组织进行跟踪观察饲养与冻存设备试剂：大肠杆菌OP50——大肠杆菌OP50是尿嘧啶渗漏突变型,作为秀丽隐
2、杆线虫的食物。NGM培养基——1000ml的NGM培养基内加有:3gNaCl,2.5g蛋白胨,17g琼脂,1mol/LK2HPO4-KH2PO4缓冲液(pH=6.0)25ml,975ml蒸馏水,灭菌后加入分别抽滤除菌的1ml胆固醇溶液(5mg/ml乙醇),1mol/LMgSO41ml,1mol/L的CaCl21mlM9缓冲液——每升缓冲液中含15.12gNa2HPO4#12H2O(或6gNa2HPO4),3gKH2PO4,5gNaCl,0.25gMgSO4#7H2O,宜现用现配S缓冲液——0.1mol/LNaCl,0.05mmol/LK2H
3、PO4-KH2PO4缓冲液(pH=6.0)喂养方法用冰M9缓冲液清洗虫体置4℃环境20min1000r离心，弃上清,沉淀物用M9缓冲液重悬置4℃环境20min弃上清取200ul沉淀物以靠接法接种到涂有大肠杆菌OP50的NGM培养基上将培养基放置到16℃生化培养箱中，72h后可繁育至第二代冻存准备1mlEP管，加入700ul30%甘油（s缓冲液溶解）用冰M9缓冲液清洗虫体置4℃环境20min，1000r离心弃去上清将虫体转入事先准备好的EP管中，置于-80℃冰箱冻存（可保存2个月），需要时取出室温解冻重置培养基研究方法及用途研究范围细胞程序性
4、死亡的遗传调控机制RNAi及其作用机制秀丽线虫的功能基因组学及其他研究低氧应答模式生物基因组学和功能蛋白组学的研究其他（MAPK信号传导、TGF-b信号传递途径、衰老和年龄及脂肪代谢等）方法——线虫基因显微注射显微注射技术是线虫研究领域的常用技术，对线虫进行转基因操作的一种高效且相对简单的方法，主要用于研究线虫突变种系的功能恢复(mutantrescue)、特定基因的过表达或异位表达、标签蛋白的表达、特定蛋白质结构域的功能、DNA或RNA调节元件的分析及RNA干扰等．此外，这项转基因技术对于特异表型的筛选也是个强有力的工具，并且它还可用于将
5、人工合成mRNAs或其他分子接引入细胞设备显微注射全套仪器琼脂糖固定垫添加了4%葡萄糖(glucose)的M9缓冲液注射步骤制剂及破针固定虫将纯化的DNA溶解在Tris-EDTA(TE)缓冲液中即可接用于注射。在注射液中加入终浓度约10mg/L的线虫基因组DNA，则会有效地提高转基因效率。将一小玻片放在加了注射油的固定垫上，操纵微操使注射针与玻片边缘相撞，若针头尖端撞破，可观察到有液泡自动渗出注射时将线虫挑至琼脂糖固定垫上，调整线虫使性腺暴露，滴加注射油覆盖整个虫体．固定好后的操作要迅速，否则线虫容易脱水而死．将琼脂糖固定垫放在载物台上，4
6、0x物镜下找到线虫，使性腺聚焦在正确的平面．操作微操或轻移滑动载物台，将注射针尖刺入性腺．启动微量加压器进行注射，能观察到注射液在性腺中快速流动，注射后的性腺被液体充满．在体视显微镜下，滴加恢复缓冲液至注射后的线虫正上方，由于与油互不相溶，缓冲液会渗入油下使线虫浮起．一般等待2～5min，线虫活力恢复，身体开始游动，即可挑至培养板上，20℃常规培养．注射恢复琼脂糖固定垫取约50ul加热溶解的2%琼脂糖(agarose)溶液滴在长宽50mmx24mm，厚0.13～0.17mm的载玻片上，用另一载玻片轻压其上，待琼脂糖凝固后(约2min)，将上
7、面的玻片从侧面滑下即可．制作好的固定垫室温过夜或65℃干燥1h后可叠放起来备用恢复缓冲液5.8gNa2HPO4，3.0gKH2PO4，0.5gNaCl，1.0gNH4Cl加水至1L，高压灭菌，用于注射后线虫的恢复注射子代目的基因表达检测注射后约3天，观察孵出的F1代是否有目的DNA表达．目前，线虫外源基因表达的标记通常用：a．荧光蛋白与目的蛋白形成融合蛋白，但需要确定荧光蛋白的连接不影响目的蛋白的功能；b．目的基因与荧光标记基因共注射；c．目的基因与具有明显表型的标记基因共注射，我们通常使用易观察的pmyo-3::TDimerII作为荧光标
8、记，它在所有体壁肌肉细胞表达，转基因效率高且本身对线虫的行为和功能没有影响。显微注射后的整合目前常用的整合方法有：用y射线和X射线照射，或用光敏剂补骨脂素加长波紫外线照射整合(T
