《细胞转染简介》PPT课件.ppt

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1、基因转染报告内容一转染的简介二转染的分类三转染的方法四转染后筛选一、转染的简介1.基因转染:将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能。2.基因转染技术已广泛应用于基因组功能研究和基因治疗研究。二、转染的分类瞬时转染稳定转染目的快速分析为获得稳定表达外源基因的单细胞克隆目的DNA与宿主染色体未整合整合表达持续时间随细胞分裂而稀释至丢失48－72小时随宿主细胞本身基因组一样复制，转录，翻译，并被稳定遗传筛选办法抗生素抗性抗生素抗性三、转染的方法基因转染的基本方法可以分为：（1）重组子的构建（2）基因转染真核细胞的方法重组子的构建1.目的基因的制备

2、和获取2.哺乳动物细胞表达载体的选择3.DNA片断的重组连接4.DNA重组体的鉴定1.目的基因的制备和获取(1)目的基因是所要研究或应用的基因，也就是将要克隆或表达的基因或基因的一个片段(2)目的基因常用的制备方法A.限制酶切除a.从原核基因组DNA制备－视原核基因组物理图谱已知或未知，克隆方法不同。b.从真核基因组DNA制备c.从已克隆的DNA片段制备B.PCR或RT/PCR方法制备目的基因a.获取已知基因据已发表的基因序列（或基因两侧序列已知）→设计/合成一对引物→PCR（基因组DNA为模板）/RT-PCR(mRNA为模板)→从组织或细胞制备目的基因b.构建RT/

3、PCR文库法获取未知基因据mRNA末端如polyA尾设计共同引物→将所用mRNA并逆转录成cDNA利用工具酶在cDNA末端加尾→采用一对共用引物扩增所有cDNA，插入适当载体→构成PCR－cDNA文库筛选C.计算机克隆－即利用GenBank信息，利用不同种属同源性设计引物，尝试获取未知基因片段，这有赖于各种计算机软件的应用。D.化学合成法制备基因片段－用DNA合成仪，对目的基因分段合成，连接，可以得到所需的目的基因。2.哺乳动物细胞表达载体的选择哺乳动物细胞表达载体有2大类：质粒型载体和病毒型载体（1）质粒型载体哺乳动物细胞质粒型载体大多数是通过细菌质粒而获得的，主要

4、是在质粒的基础上插入了一些病毒或其他一些物种及人的基因表达调控序列。A.典型的哺乳动物细胞表达载体需要以下顺式作用元件:a.启动子b.增强子c.多聚腺苷酸化信号d.药物选择标记基e.报告基因f.表位标签B.常用的哺乳动物表达质粒载体a.pcDNA3.lb.pSIc.pCMV-HAd.pBudCE4.1e.pTRE2）病毒型载体病毒型载体已被广泛地用于将外源基因导入哺乳动物细胞或替换哺乳动物细胞中的缺陷基因，这类载体将来在基因治疗中将具有非常重要的价值。目前应用的病毒类型包括：逆转录病毒、腺病毒、牛痘病毒和杆状病毒等。A．逆转录病毒载体逆转录病毒的优点是，可以使外源基因

5、整合到基因组中，因而可以被稳定传代和表达。但是，由于逆转录病毒的插入位点是随机的，因而在基因组内的整合有可能破坏一些内源基因的结构，尤其是当插人到一些重要的基因位点时会导致细胞的异常。B.腺病毒载体易于培养、纯化，在感染过程中复制与转录依赖于宿主细胞的聚合酶，可插入较大的外源基因片段，且腺病毒基因不会发生整合，是研究真核基因的良好模型。3.DNA片断的重组连接粘端连接方法要点平端连接方法要点①单酶单切点防自身环化，希望定向插入；②双酶双切点定向克隆，构建表达载体的最好用此法；③利用同裂解酶产生相同粘端。①平端，平端连接；②Linker连接酶切产生粘端连接；③Adapt

6、or衔接目的基因和载体；④同源同聚尾，克隆cDNA的最好方法⑤T载体，PCR产物T/A克隆法连接4.DNA重组体的鉴定外源DNA片断是否插入载体构成重组DNA分子，而插入片断大小，是否突变及插入位置，顺序及方向则关系到构建载体是否扩增，我们所需要的基因或表达，表达相应的产品，所以需要进一步鉴定DNA重组体（1）酶切鉴定是必需的，基于下述:A.限制性图谱个体特异性，不同的载体或DNA分子物理图谱不同，酶切后片段大小不一样，电泳图谱不一样。B.同一载体连接不同的DNA片断，不同的载体连接同一片段(片段上也有位点）酶切图谱是不同的。C.插入法(单酶单切点)或替代法(双酶双位

7、点)酶切，一般来说用3种限制酶切：①可鉴定载体及②插入片段的大小,方向,切后并电泳分析,以确定是否得到预期的rDNA。2）若构建DNA重组体是为了克隆某个基因，可进行在序列测定。（3）若构建表达载体，可进行表达产物鉴定。基因转染真核细胞的方法(1).DEAE-葡聚糖是最早应用哺乳动物细胞转染的试剂之一。DEAE-葡聚糖是阳离子多聚体,它与带负电的核酸结合后接近细胞膜而被摄取。DEAE一葡聚糖转染已成功地应用于瞬时开始，但用于稳定转染却不可靠。(2).磷酸钙共沉淀转染法由于试剂易得、价格便宜而被广泛用于瞬时转染和稳定染的研究。方法是，先将DNA和氯化钙