《基因转染技术》PPT课件

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1、分子生物学技术在药理中的应用基因转染技术主要内容概述1基因运载系统转染的基本过程外源基因的表达和检测2345主要应用一、概述基因转染的定义：将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能。基因转染技术：将纯化的含有靶基因的质粒DNA送入细胞内，并在细胞内表达。基因转移技术已广泛用于基因的结构和功能分析、基因表达与调控、基因治疗与转基因动物等研究。基因转染方法转染通过生化或者物理方法将目的基因导入真核细胞中。方法分类感染通过病毒介导，用基因组中携带有克隆目的片断的病毒来感染靶细胞。二、基因运载系统将某一特定的靶基因传

2、递到靶细胞，需要应用某一基因运载系统，目前将这一系统概括为两大类：非病毒方法和病毒方法（一）非病毒方法分类直接注射法磷酸钙共沉淀法脂质体染法显微注射法受体介导的基因转移电穿孔法微粒子轰击法DEAE-葡聚糖和polybrene聚阳离子法精子载体法为什么需要应用转染试剂或其他方法?DNA:带负电荷、亲水Noionicinteraction++++++++++Cationicmacromolecule++++++CationicReagentMembrane:anionicandhydrophobic------

3、----HeparanSulfateProteoglycanes、1、直接注射法将含有DNA的溶液直接注射到肌肉，以引起邻近的细胞摄入DNA链进行表达，在肌细胞中，基因表达可持续数月。、2、磷酸钙共沉淀法将氯化钙、DNA和磷酸盐缓冲液混合，形成磷酸钙微沉淀，附着于细胞膜并经过细胞内吞作用进入细胞质。该方法的转化效率通常很低。影响因素：（1）DNA-磷酸钙共沉淀物中DNA的数量（2）共沉淀物与细胞接触的保温时间（3）甘油或DMSO等促进因子作用的持续时间等。一般说来，在磷酸钙转染实验中要使用高浓度的DNA(1～50ug/ml)。DNA磷

4、酸钙共沉淀物同细胞接触的最适保温时间，因细胞的类型而异。促进因子通常是在DNA-磷酸钙共沉淀物被细胞吸收4～8小时之后再加入。、3、脂质体转染法脂质体能在体内或体外提供运载外源性遗传物质进入细胞的载体。制备程序比较简单，可以通过多聚碳酸脂滤膜(polycarbonatefilter)消毒灭菌，用它包装的DNA在4℃下可长期保存不失活性，以及毒性低、包装容量大、可保护DNA免受核酸酶的降解作用等等脂质体介导的基因转移的最大优势在于能在活体内应用。、图1.阳离子脂质体介导的转染、4、受体介导的基因转移依靠受体介导的细胞内吞途径以转移外源基

5、因。受体介导的基因转移方法是在质粒DNA和某种特异的多肽（配体）之间形成复合体，而这种多肽能为细胞表面的受体所识别。如若将DNA在体内运送至肝内，可以选去唾液酸糖蛋白受体介导系统(肝.实质细胞)和甘露糖受体介导系统(肝.非实质细胞)、聚阳离子受体介导的转染过程、5、显微注射法在显微镜下，将DNA经同细胞玻璃针直接注入细胞，该法适合于各种培养生长的细胞，但需要一定的设备和操作技巧。、6、电穿孔法电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。即利用脉冲场将DNA导入培养细胞。电脉冲和场强的优化对于成功的转染很重要。在高压电场的作用下

6、，细胞膜发生临时性破裂形成微孔微孔的关闭：一种天然衰减的过程，在0℃下，这种过程会被延缓进行。电穿孔之前若用秋水仙酞胺(colcemid)预处理细胞10小时，可提高转化效率3～10倍。电穿孔转染效率主要取决于所用的细胞类型。主要征对不适合用传统方法转染的细胞准备DNA:构建提质粒线性化准备细胞：0.5～1×107将细胞、DNA加入电极杯冰上预冷（！）设置电脉冲参数电击常温静置转移细胞至培养皿24－36小时后加筛选药物如：G418筛选，4－5天细胞开始死亡，2周后出现阳性细胞的克隆增殖，4－5周后可以挑克隆鉴定、7、微粒子轰

7、击法（基因枪）在真空状态下，利用粒子加速器将外面包裹了外源基因DNA的金颗粒或钨粉微颗粒进行加速，打入完整的细胞中，从而使外源基因DNA得以在靶细胞中稳定转化并有可能获得表达。实验结果表明，用这种方法靶基因可在皮肤、肌肉、肝、胰、胃和乳腺等细胞中表达。美國Bio-Rad公司PDS-1000型/He基因槍、8、DEAE-葡聚糖和polybrene聚阳离子法二乙氨乙基葡聚糖(diethyl-aminoethyl-dextran)带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的DNA分子使得DNA可以结合在细胞表面。通过使

8、用DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA复合体导入。DEAE－葡聚糖仅限于瞬时转染。、9、精子载体法用精子和NDA（吡啶核甘酸辅酶）-剂孵育，可捕获得DNA。通过受精过程，将外源性基因导入受精卵，大大简化了转基因动物的制备