组培具体操作.doc

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1、植物组织培养具体操作二、植物组织培养过程（以菊花叶片为外植体）1、培养基的配制:MS培养基母液的配制：MS培养基含有近30种营养成分，为了避免每次都要对这几十种成分进行称量，可将培养基中的各种成分，按照比例配制成MS培养基干粉，用时直接取用即可。每42gMS培养基加1L蒸馏水。MS培养基的配制：取1000mL烧杯，称取42gMS培养基干粉于不锈钢盆中，加水至800ml。使用电磁炉加热使琼脂溶解，按照要求加入浓度为0.5mg/ml的激素NAA0.2ml，定容至1000ml，用1mol/LNaOH和1mol/LHCl调节pH至6.0。将配好的培养基迅速分装至1

2、50ml组培瓶中，拧上盖子，整齐的放入到高压蒸汽灭菌锅的物料篮内，121℃下灭菌20min。将培养皿用报纸包好，一起放入灭菌锅进行灭菌。高压蒸汽灭菌锅的使用注意事项：1、排气管通入到盛水的桶中，避免蒸汽将人烫伤。2、放入灭菌物品后，拧紧阀门，打开开关进行灭菌。3、在压力表归零之前切勿试图开盖。2、接种仪器及器具仪器：超净工作台光照培养箱接种器具杀菌器器具：枪形镊剪刀器具架酒精灯培养皿酒精棉球3、外植体类型实验室做植物组织培养实验时采用的是无菌苗，一般以菊花作为培养对象，其中分为芽培和叶培。芽培：将无菌苗的带有芽的嫩枝条插入生根培养基，经过培养后直接生长并生

3、根，形成一个大的完整的植株。达到了扩大繁殖培养的目的。叶培：使用的是诱导培养基，先将叶片剪碎后接种到培养基上，叶片组织经过脱分化会形成愈伤组织，然后经过再分化形成不定芽，转接到生根培养基上之后继续培养，可生长成为一个完整的植株。此外还可以用植物其他的离体器官、组织以及细胞等作为外植体，但就我们实验室的条件暂时使用叶和芽作为外植体进行培养。除无菌的菊花苗外，还可以使用烟草、矮牵牛、小丽花以及百合等无菌苗进行扩大繁殖培养。它们的培养基添加激素的浓度不一样，其他都相同。菊花无菌苗示意图用带一个叶和一个芽的嫩枝为外植体，将形态学的下端插入培养基。4、菊花的接种与培

4、养1)植物组织培养实验室内打开紫外线杀菌照射装置半小时后关闭，打开风机通风半小时。2)超净工作台内同时进行紫外线照射和通风步骤。并将枪形镊和剪刀放到接种器具杀菌器上。3)将组培苗、培养基以及培养皿准备到超净工作台上，将工作台玻璃门半关，双手伸入。4)将灭菌完毕后的镊子和剪刀放到架子上，注意不要放到工作台上。5)点燃酒精灯，用酒精棉球擦拭双手以及工作台。并用酒精棉球擦拭剪刀和枪形镊。6)镊子和剪刀在使用前和使用之后都要在火焰上进行灼烧，待冷却后再接触无菌苗。7)将培养皿在火焰旁转圈后打开，放到酒精灯附近的工作台操作区域。8)将组培瓶瓶盖在火焰旁迅速灼烧后打开

5、盖，将盖子朝上放置，此步骤不要在培养皿上方进行。避免污染培养皿。9)左手持镊子，右手拿剪刀，将组培苗按照要求剪碎到培养皿中。然后盖上培养皿盖子。10)将用完的组培瓶瓶口和盖子都在火焰旁迅速灼烧后盖上。11)掉到试验台上的组培苗应该抛弃，不能再用。12)培养基瓶盖打开和盖住之前都要在火焰旁迅速灼烧，右手持枪形镊夹取外植体，注意将形态学的下端轻轻插入培养基，不要将芽的部分插入培养基。接种完毕后灼烧后盖盖。13)整理工作台，将自己接种的组培苗贴上标签，标注自己的姓名、外植体名称以及接种日期，然后放到光照培养箱内进行培养。每天光照15小时，暗培养9小时，23℃下恒

6、温培养。【注意事项】1)整个操作过程中都要严格的灭菌。保证绝对的无杂菌污染。所有操作都要在火焰旁进行。2)剪刀和枪形镊在使用前要用火焰灼烧，冷却后再接触无菌苗，使用完后再进行灼烧，放到架子上，接触无菌苗部分一定要腾空。3)组培瓶打开前要在火焰旁转一周，打开后瓶口和瓶盖都要在火焰旁迅速灼烧，盖盖之前也要进行此操作。4)无关操作尽量不要在培养皿的上方进行，避免杂菌污染。