铁皮石斛组培方案.doc

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1、铁皮石斛组织培养方案报告一、实验目的了解铁皮石斛培养的方法和步骤，熟练掌握外植体的取材、消毒、接种、初代培养的操作过程。二、实验器材超净工作台、高压灭菌锅、电磁炉、长镊子、培养皿、酒精灯、接种工具、烧杯、玻璃棒、移液管、培养箱、剪刀、培养瓶等。三、实验步骤配方：根据不同阶段，培养基配方有所差异。如表1表1各种培养基配方不同阶段培养基备注愈伤组织（原球茎）的诱导MS+2.0mg/L6-BA+3%蔗糖+0.8%琼脂pH=5.8原球茎的增殖MS+20%马铃薯+3%蔗糖+0.8%琼脂pH=5.8原球茎的分化MS+20%马铃薯+2.0mg/LNAA+3%蔗糖+0.8%琼

2、脂pH=5.8幼株的生根壮苗MS+10%香蕉+2.0mg/LNAA+3%蔗糖+0.8%琼脂pH=5.4-5.6配制（以1000ml幼株的生根壮苗培养基为例）10%香蕉（w/w）+MS+3%蔗糖（w/w）+0.8%琼脂（w/w）+2.0mg/LNAA1）量取800ml蒸馏水于洁净的大烧杯中，加热至沸腾；2）准确称量100g香蕉果肉，切成碎片状，并倒入上述烧杯中，加热煮沸5min，其间搅拌使之充分溶解；3）按照大量、微量、Fe2+盐、有机Ⅰ、有机Ⅱ顺序，量取MS各种母液于盛有50ml蒸馏水的烧杯，混合均匀；4）将2）和3）的溶液混合，然后加入30g蔗糖，并移取2m

3、lNAA（0.1mg/ml），混合均匀；5）加热至沸腾，加入8g琼脂并煮沸5min，其间不断搅拌使之充分溶解；6）冷却至50±5℃时，调pH至5.4—5.6。分装于培养瓶内，33.3ml/瓶。注意事项：①溶解香蕉的蒸馏水尽可能多，以确保香蕉各种成分完全溶解；②各种母液混合时，要按照大量、微量、Fe2+盐、有机Ⅰ、有机Ⅱ的顺序；③煮沸时，小心溶液溢出；④分装时不要污染培养瓶瓶口。灭菌：1）检查灭菌锅的水位、电源、排气阀、排气管、安全阀以及压力表，确保灭菌锅各指标和功能的正常，以防事故发生；2）把带灭菌的培养基装入锅内，盖上锅盖，对称而均匀地扭紧螺丝；3）打开电源

4、和排气阀，调节电压至220V；4）待排气阀排除水蒸气30s—1min后，关闭排气阀；5）当温度上升到121℃后，调节电压至135V，保持20min；66）关闭电源，使之自动降温至0℃。10min后，打开排气阀和锅盖；7）5—10min后，取出培养基放于试验台上冷却，待用。表2灭菌时间统计阶段单锅灭菌（耗时64min）多锅连续灭菌第一锅（耗时63min）第二锅（耗时46min）起始22:218:049:30排气22:418:239:43T=121℃22:508:329:50关闭电源23:108:5210:10气压降至023:259:0710:16注意事项：①启动

5、灭菌前，应检查水位、电源、排气阀、安全阀、排气管等，确保正常；②灭菌锅底部应铺垫一层报纸，以防培养瓶机械破损；③灭菌电压不宜超过220V，否则灭菌锅会剧烈摇晃，造成不必要的损害和安全隐患；④当温度达到121℃后，调节电压至135V，并且时不时注意温度的变化，确保温度介于121-122℃之间；⑤气压降至0后，不宜立即揭盖；最好在5-10min后揭盖，这样才能缓和内外“气压和温度差”；⑥揭盖5-10min后，再转移锅内培养基，以免烫伤。⑦每锅只能灭菌18瓶转接转接前准备1）培养皿、镊子、剪刀等转接用具的灭菌（可以在培养基灭菌时附带）；2）检查超净台内各种用具，及时

6、补充酒精灯的酒精，确保用具齐全；3）放置待转接材料和待接入培养基，以“方便操作为宜”而陈列；转接1）揭去防尘膜，打开电源、通风和紫外灯，灭菌15—20min；2）关掉紫外，打开白炽灯，用75%酒精仔细擦拭手指、指甲、材料瓶瓶盖及盖边缘、工作区等处，确保“消毒”彻底；3）点燃酒精灯，用无菌镊子把材料夹取于无菌培养皿内，挑选生命力旺盛的植株用于转接；4）用无菌剪刀修去多余的根系，“双镊子”法将材料转接于新的培养基中；5）标注相关日期和品系，转至培养室培养。注意事项①操作时，所有用具均不能从“核心工作区”和开启的培养瓶上面晃过，防止细菌落入而导致污染；②在打开材料瓶

7、和培养瓶后，其盖均在酒精灯外焰灼烧3-5s，瓶口灼烧5-10s；盖瓶盖时，亦如此操作；③转接时，确保手一直在超净台内，以免带入外界细菌。培养：培养条件：白炽灯12h/黑暗12h＋20℃PDA培养基的配制方法，培养基的湿热灭菌操作6一、目的要求1．学习并掌握配制培养基的一般方法和步骤。2．学习并掌握棉塞的制作方法。二、培养基的配制原理培养基是人工配制的各种营养物质供微生物生长繁殖的基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。在自然界中，微生物种类繁多，营养类型多样，加上实训和研究的目的不同，所以培养基的种类很多，但不论是何种培养基，均应含有水分、碳

8、源、氮源、能源、无机盐等。不同微生物对