色谱与质谱联用技术在蛋白质翻译后修饰研究中的进展及应用.pdf

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1、第43卷分析化学(FENXIHUAXUE)特约来稿第1O期2015年10月ChineseJournalofAnalyticalChemistry1479～1489DOI：10．11895／j．issn．0253-3820．150485色谱与质谱联用技术在蛋白质翻译后修饰研究中的进展及应用林琳，罗树生，王灵珏杨杰沈海南田瑞军(南方科技大学化学系，分析测试中心，深圳市细胞微环境重点实验室，深圳518055)摘要蛋白质翻译后修饰是调控各种细胞信号通路和细胞命运最为关键的分子机制之一。在分子水平上，蛋白质翻译后修饰的“写入”、“擦除”和“识别”是实现其动态调控功能的核心过

2、程，均属于生物分析化学的研究范畴。基于液相色谱与生物质谱联用的蛋白质组学技术经历了近十年的高速发展，已成为系统水平上表征各种蛋白质翻译后修饰的标准方法。本文综述了蛋白质翻译后修饰分析相关的关键技术和方法进展，主要包括：各种翻译后修饰蛋白质和多肽的富集方法、基于高效液相色谱的多维分离方法和各种生物质谱鉴定方法．并重点阐述了近年来的新的发展方向。基于相关技术的快速发展和大规模鉴定数据的产生，本文重点介绍了5种具有重要生物学功能的蛋白质翻译后修饰，包括：磷酸化、糖基化、泛素化、乙酰化和甲基化。生物分析化学领域的方法和技术创新必将进一步促进对蛋白质翻译后修饰的系统水平研究

3、的发展。关键词蛋白质翻译后修饰；蛋白质组学；质谱；综述1引言蛋白质翻译后修饰是蛋白质水平发生的一种重要的生物化学过程，可为蛋白质的特定氨基酸位点引入各种化学基团，例如磷酸根、糖基、甲基、乙酰基和泛素链等。在哺乳动物表达的所有蛋白质中，超过50％的蛋白质可以在特定时间和亚细胞空间发生各种各样的翻译后修饰，并且调控着许多重要的生物学功能『1]。目前，已陆续发现近300种蛋白质翻译后修饰，其中很多重要的翻译后修饰都是以可逆方式被相关酶调控的[2]。这些可逆的蛋白质翻译后修饰是动态调控蛋白质功能的重要方式，同时也为生物体系提供了更高层次的复杂度。以具有重要生物学功能以及研

4、究最为广泛的蛋白质磷酸化为例，使底物蛋白质发生磷酸化修饰的酶是激酶。而使磷酸化蛋白质发生去磷酸化的酶是磷酸酶。在人类基因组中。分别有5l8种激酶和约137种磷酸酶。激酶和磷酸酶常有多种底物蛋白质，而每种底物蛋白质往往有多个磷酸化位点。这些被磷酸化的氨基酸序列常会特异性地被蛋白结构域所识别(例如SH2、PTB、BRCT结构域等)．从而形成基于磷酸化的蛋白质间相互作用l4j。如图1A所示，正是由于细胞内存在着数目庞大的可以“写入”、“擦除”和“识别”磷酸化位点的蛋白质，形成了一个极为复杂的由磷酸化介导的信号转导网络。从分子水平上，上述细胞内的生物化学过程主要涉及各种修

5、饰基团的“写入”和“擦除”．以及蛋白质间基于特定修饰基团的“识别”。这类分子机理正是生物分析化学研究的核心生物学问题之一。传统的蛋白质翻译后修饰研究主要依赖于基于特异性抗体的免疫检测技术或放射性标记技术。这些方法对研究由单一位点翻译后修饰介导的细胞信号转导过程起着不可替代的作用。然而，由于上述技术存在操作要求高、特异性抗体制备周期长等缺点，很难实现蛋白质翻译后修饰的大规模检测。近年来，基于液相色谱与生物质谱联用技术(LC．MS)的蛋白质组学策略发展迅速，为系统水平上的蛋白质翻译后修饰研究提供了强有力的研究工具[5I6]。应用于蛋白质翻译后修饰研究的研究策略与鉴定一

6、般多肽样品的LC．MS流程是基本一致的。然而，蛋白质翻译后修饰研究常具有极大的技术挑战，这主要是因为：(1)被修饰蛋白质通常仅占总体蛋白质表达量的很小一部分；(2)翻译后修饰基团常具有化学稳定性差、在样品制备和LC—MS分析过程中容易丢失的缺点；(3)蛋白质翻译后修饰常是动态调节过程，这为样品制备和LC—MS分析提出了更高的要求。2015-06．13收稿；2015-08-24接受本文系南方科技大学启动经费和教育部留学回国人员科研启动基金(No．K15211203)资助}E-mail：tian．ri@sustc．edu．on第10期林琳等：色谱与质谱联用技术在蛋白质

7、翻译后修饰研究中的进展及应用实现在几千到上万个位点的定性和定量表1近年来，大规模蛋白质翻译后修饰位点鉴定工作Table1Summaryofrecentlarge—scaleposttranslationalmodification表征(表1)。本文主要针对翻译后修饰(PTM)mapping蛋白及相应的酶解多肽的色谱富集技术、色谱分离技术及质谱检测技术进行了综述。基于其生物学重要性和相关分析技术快速发展，本文重点综述蛋白质磷酸化、糖基化、泛素化、乙酰化和甲基化相关的研究进展，并对未来发展方向提出若干展望。2翻译后修饰蛋白及多肽的富集方法2．1磷酸化修饰磷酸化修饰是细

8、胞信号转导