硅锆复合氧化物的制备、表征及其在磷酸化肽段富集中的应用.pdf

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1、第38卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第9期2010年9月ChineseJournalofAnalyticalChemistryl231～1237一研一DOI：10．3一724告／SP．J一．1096．2010．01231硅锆复合氧化物的制备、表征及其在磷酸化肽段富集中的应用吴剑虹肖矿赵勇章伟平郭林冯钰铸(武汉大学化学与分子科学学院，生物医学分析化学教育部重点实验室，生命科学学院，武汉430072)摘要采用溶胶一凝胶法制备了氧化硅一氧化锆复合氧化物(SiO一ZrO：)，并对其物理与化学性质进行了详细地表征。以OL一酪蛋白的酶解

2、产物为探针，比较了氧化硅一氧化锆复合氧化物与氧化锆对磷酸化肽段的富集能力。结果表明：在pH<2时富集，SiO2-ZrO：对磷酸化肽的选择性要优于ZrO2；使用SiO2-ZrO2材料时，多磷酸化肽段的回收率更高。结合MALDI—TOFMS检测技术，SiO：一ZrO成功地应用于脱脂牛奶酶解产物中磷酸化肽的分离和富集。关键词氧化硅～氧化锆复合氧化物；磷酸化肽段；富集；基质辅助激光解吸飞行时间质谱1引言磷酸化是生物体内一种广泛的翻译后修饰形式。目前估计在任一时期真核生物总蛋白中都约有1／3是被磷酸化的⋯。蛋白质可逆的磷酸化和去磷酸化控制着一系列的

3、生物学过程，如信息传导、分子识别及相互作用和其它的细胞活动口。若要在分子水平上认识这些过程，就需要对蛋白质的磷酸化位点进行识别和鉴定。质谱的高灵敏度及强大的序列分析能力，使其成为蛋白质磷酸化分析的主要方法。由于生物样品中磷酸化肽段的含量通常很低，在质谱分析前需对磷酸化肽段进行富集。目前应用最广泛的富集方法为固载金属离子亲和色谱法(IMAC)，但是该方法的选择性和重现性不高。近来，金属氧化物(TiO，A1O和ZrO等)逐渐在磷酸化多肽富集方面得到了应用。这些金属氧化物表面都存在Lewis酸活性中心，能接受酸根(如PO一，COO，CO；一，s

4、0一)的孤对电子形成配合物，对多肽混合物中的磷酸化肽具有一定的选择性。其中氧化锆材料具有很好的化学稳定性，与POj一之间存在很强的Lewis酸碱作用，相比之下与其它酸根的作用则较弱，理论上ZrO对磷酸化多肽应具有较高的选择性。基于此原理，Hfikansson等⋯将ZrO材料用于多肽混合物中磷酸化肽段的富集，并将分析结果同TiO，的富集方法进行了比较。结果表明，ZrO对只带有一个磷酸化位点的肽段有较好的富集能力，但是对于带多个磷酸化位点的肽段，其富集能力不如TiO，材料，作者推测这一现象与材料的表面化学性质相关，在实际应用中两种材料可互为补

5、充。复合氧化物通常表现出与单一氧化物不同的物理化学性质，如晶体结构、孔结构、表面性质等。二元或多元氧化物已被广泛用作催化剂、吸附剂、离子交换剂等¨。本课题组曾经从制备、表征到正相、反相色谱性能等方面对氧化锆及氧化锆的复合氧化物如MgO—ZrO：，SiO一ZrO：，CeO：一ZrO：和CaO—ZrO，等作为色谱填料进行了较系统的研究l】卜盟J，但是有关复合氧化物用于磷酸化肽的富集却鲜有报道。本研究采用溶胶一凝胶法制备了硅锆复合氧化物(SiO：一ZrO)，并对其物理化学性质进行了研究；将该复合氧化物用于磷酸化肽的富集，并对富集条件进行了优化；

6、考察了SiO．ZrO：在富集特性方面与单一氧化物的不同，最终将其成功地应用于脱脂牛奶酶解产物中磷酸化肽的富集。2010~1-07收稿；2010-04—2I接受本文系国家科技部973计划(No．2007CB914200)资助项目Email：guol@whu．edu．en；yqfeng@whu．edu．CH分析化学第38卷2实验部分2．1仪器与试剂VoyagerDESTR基质辅助激光解吸电离一飞行时间质谱(MALDI—TOF-MS，美国ABI公司)；XSAM800X一射线电子能谱(XPS，英国Kratos公司)；台式高速离心机(上海安亨科学仪

7、器厂)；Jw—BK静态氮吸附仪(北京精微高博科学技术有限公司)；DELTA320pH计(瑞士Mettler—Toledo公司)；超纯水装置(Milli—Q公司)。失水山梨醇单油酸酯(Span80，HLB=4．3，化学纯)、聚氧乙烯失水山梨醇三油酸酯(Tween85，HLB=11．0，化学纯)、NaSiO、丙酮、无水乙醇、ZrOCI·8H0、尿素、六亚甲基四胺、石油醚、NaOH、浓HC1及其它试剂均为分析纯(上海国药集团化学试剂有限公司)；乙腈(HPLC，J&KChemiea公司)；氨水(i>25％)、冰醋酸(HAC，I>99％)、2，5一

8、二羟基苯甲酸(DHB，98％)、HPO(85％～90％)、三氟乙酸(TFA，1>99％)及一酪蛋白、胰蛋白酶(Trypsin，无测序级)均购自美国Sigma公司；蒙牛高钙低脂牛奶购自超市。2．