烟草瞬时转化实验步骤.doc

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1、烟草叶片瞬时转化实验试验方法一、实验材料及药品pCAMBIA1381Z-Luc载体、Gv3101农杆菌菌株及其感受态、MES、MgCl2、乙酰丁香通、5-6周本氏烟草等二、载体构建及农杆菌转化烟草瞬时转化实验选用融合Luc信号的pCAMBIA1381Z-Luc载体，载体构建过程是将拟南芥及菊花的FT启动子分别采用双切双连的常规载体构建方式将启动子构建到pCAMBIA1381Z-Luc载体上，同时将目的基因构建到pMDC43或pMDC32或pORE载体上作为超表达载体进行后续的瞬时转化实验。通过农杆菌转化的方式，将上述构建好的质粒转化到农杆菌菌株GV3101的感受态细胞中。三、材料的准备1、烟草

2、植株5-6周幼嫩未开花植株2、携带质粒的农杆菌（GV3101或An105均可）3、YEB培养液（一瓶+K+R、一瓶只+R——pCAMBIA1381Z-Luc载体为卡纳氯霉素抗性、Gv3101只有r抗性）4、处理液：10mL配方如下母液配方（10ml配方）：0.5MMES200ul0.976g1MMgCl2100ul2.03g100mM乙酰丁香酮10ul0.196g（使用DMSO溶解）灭菌水加至10ml（若长时间保存，需避光！）四、操作步骤1、农杆菌转化2、转化正确的农杆菌进行过夜培养，同时培养P19菌株（最好先进行划线）3、确定不同农杆菌所加菌液的量：计算公式：V=n×Vfinal×0.5/O

3、D600VP19=n×Vfinal×0.3/OD600OD600最好在1以上n=注射叶片数Vfinal=悬浮后的终体积多为2ml或3ml注：在进行转录激活或抑制实验时，一般加入四种农杆菌（包括P19）而对照组往往只加入两种或三种菌液，此时，应使用Gv3101对体系进行补充，计算方法为公式一，具体加入量视对照组缺失的量确定，分别加入一倍或两倍Gv3101进行补充。4、将计算出的各菌液体积进行混匀（此时各菌液实际浓度比例为1:1:1），5000rpm，5min5、弃上清，用Vfinal（2ml或3ml）悬浮液进行悬浮，随后室温避光放置3h6、利用无针头注射器注射叶片（先用针头在叶片上扎一个小孔）（

4、注射烟草顶端以下第3-5片叶片）7、暗培养1d，转入光照培养1-2d8、利用稀释好的荧光素酶底物喷施到叶片上，黑暗下放置1-2min，随后利用CCD冷冻相机进行观察。荧光素酶的配置：固体0.032g溶解于1ml灭菌水中，用前吸取该溶液100ul稀释到10ml水中，并加入10ulTriton-X-100（全程避光）。