烟草组培苗实验步骤.docx

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1、烟草叶片的组织培养一、实验原理与实验步骤在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：起动期、分裂期和形成期。植物材料：烟草植株药品：（2,4-D、NAA、6-BA浓度均可）、1mol/LNaOH、1mol/LHCL蒸馏水、70%酒精0.01%升汞仪器：玻璃杯 、玻璃棒、pH试纸(5.5-9.0)  、1瓶无菌水、1个无菌烧杯、1包无菌滤纸、  1个无菌白瓷板 、 培养瓶若干   

2、 移液器、  微波炉、  灭菌器、  超净工作台、   酒精灯、  解剖刀、  镊子二、实验方法与步骤1、MS培养基母液的配制母液成分规定量(mg/L)浓缩倍数称取量（mg）母液定溶体积（ml）配1LMS培养基吸取量（ml）编号种类1大量元素KNO319001019000100010NH4NO3 16501016500MgSO4·7H2O3701037000KH2PO41701017002CaCl2·2H2O440104400100010MnSO4·4H2O22.310022301000103微量元素ZnSO4·7H2O8.6100860

3、H3BO36.2100620KI0.8310083Na2MoO4·7H2O0.2510025CuSO4.5H2O40.0251002.5CoCL2.6H2O0.0251002.54铁盐Na2-EDTA37.31003730100010FeSO4.4H2O27.810027805有机物甘氨酸2.05010050010盐酸吡哆醇0.55025盐酸硫铵素0.1505烟酸0.550256肌酸10050500050010注意：1、大量元素按照使用时高10倍的数值称取，分别将各种化合物称量后，除CaCl2·2H2O单独配制外，其余化合物混合在500m

4、l烧杯中加适量蒸馏水溶解，用玻璃棒搅拌促溶，倒入1000ml容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，置小口瓶中保存，贴上标签注明化合物名称（或编号），浓缩倍数，配制日期和配制者姓名，CaCl2·2H2O配制同上置于另一小口瓶中。 2、微量元素母液的配制按要求浓缩100倍的数值称取，分别将各种化合物称量除铁盐（FeSO4·7H2O和Na2-EDTA.2H2O）作为一组单独配制外，其余化合物可混合置于烧杯内加少量蒸馏水溶解后，定容在1000ml容量瓶中，置小口瓶中保存，贴上标签3、铁盐配制将FeSO4·7H2O和Na2-EDTA.2H2O分别溶于450m

5、l蒸馏水中，加热，（很重要）不断搅拌，溶解后，两液混合，调PH至5.5加水定容至1000ml，置于小口瓶中，贴上标签。 4、有机物母液配制，按母液要求浓缩50倍，除蔗糖按3%单独临时称量外，其余分别称量后，溶解，定容在500ml容量瓶中，置于小口瓶中保存，贴上标签。 5．母液最好在2~4℃的冰箱中贮存，特别是有机类物质，贮存时间不宜过长，无机盐母液最好在一个月内用完，如发现有霉菌和沉淀产生，就不能再使用。 （1） 制备母液和营养培养基时，所用蒸馏水或无离子水必须符合标准要求，化学药品必须是高纯度的（分析纯）。（2） 称量药物采用高灵敏度的

6、天平，每种药品专用一药匙。生长调节剂母液配制：    为了操作方便，节约时间，生长调节剂也可如同配制母液一样，先配成原液，这样配制培养基时只要稍加计算，按需要量取即可。    不同药品在配制时若不溶于水，可用少量不同的溶剂先溶解，萘乙酸（NAA），吲哚乙酸（IAA）,赤霉素（GA3），2，4-D等生长素和玉米素（ZT）可先用少量95%酒精溶解，然后加水，如溶解不完全再加热。激动素（KT）和6-苄基嘌呤（BA）可溶于少量1mol/L的盐酸中，叶酸需用少量稀氨水溶解。 称取50mg生长调节物质，溶解后，在100ml的容量瓶中定容，配制的母液每

7、毫升则含有生长调节物质0.5mg，配制后一般要求在低温（0~4℃）保存，配制培养基时如每升（1000ml）需添加的生长调节剂物质为0.5mg时，则取1ml母液即可。三、培养基配制和灭菌本次实验使用 （1）愈伤组织诱导及其幼芽分化培养基:MS+2,4-D 0.5 mg/L +6-BA 1.0 mg/L； （2）幼芽增殖培养基：MS+6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.2 mg/L； （3）生根培养基：MS+NAA 0.2 mg/L。 注意事项：上述培养基均在MS固体培养基溶化后降低到50左右后，加入相应激素所得， MS固体培养基的配置

8、过程在此不作过多赘述 上述培养基均附加3%蔗糖，0.8%琼脂，pH5.8，培养温度25±2℃，光照强2000lx。母液吸取量的计算