基于高分辨质谱技术的农药与生物大分子相互作用的分析方法.pdf

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1、第44卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第2期2016年2月ChineseJournalofAnalyticalChemistry2l8^-223DOI：10．11895／j．issn．0253-3820．150725基于高分辨质谱技术的农药与生物大分子相互作用的分析方法李康丽王玲玲暴雅静熊博王震宇(华中师范大学农药与化学生物学教育部重点实验室，武汉430079)摘要建立了检测农药小分子与生物大分子(BSA蛋白，SOD酶)相互作用的高分辨质谱分析方法。对相应结合产物进行质谱检测，结果表明，BSA蛋白与甲基对硫磷分子在开始相互作用30min后达到饱和，且每个蛋白分子最多与5个甲基对

2、硫磷分子结合；BSA蛋白与甲维盐不存在相互作用。通过对SOD酶与敌敌畏，阿维菌素及噻呋酰胺结合产物的质谱检测发现每个SOD酶最多结合2个敌敌畏分子，1个阿维菌素分子，且不与噻呋酰胺相互作用。此外，实验表明，SOD酶与阿维菌素分子作用30min后达到平衡，与敌敌畏分子作用20min后达到平衡。通过对两种蛋白结合农药小分子过程的时间分辨分析发现，两种生物大分子结合农药小分子的机理过程存在差异。本方法与相关标准方法(荧光光谱法，NBT试剂盒法)及分子模拟对接结果比对说明，本方法切实可靠。本方法具有耗样量少、检测速度快、可提供多方面信息等优点，在新农药的研发及其安全性评价方面具有实用价值。关键词高

3、分辨质谱；分子相互作用；农药；牛血清白蛋白；超氧化物歧化酶1引言农药在确保粮食安全、农业稳产增收等方面发挥着重要作用，新农药的研发具有相当的社会价值和现实意义j。大部分农药为有机小分子，多通过特异性结合对应靶标蛋白抑制生物体的生理功能_2．3J，进而达到除草、杀虫等目的。因此，研究农药与生物大分子的相互作用不仅对相关药理研究具有重要意义．5，而且有望为新农药的研发提供理论基础和技术支撑。目前，基于核磁共振，、光谱_8、圆二色谱J、分子模拟对接’m等技术检测小分子与生物大分子相互作用已见诸报道，这些方法不同程度地存在样品消耗量大、耗费时间长等不足。鉴于此，本实验建立了用于监测农药．生物大分子

4、相互作用的高分辨质谱分析方法。通过对质谱检测条件的充分优化，实现了对农药一生物大分子结合产物的质谱分析lI，基于蛋白结合农药前后的质量数位移，确定单个蛋白分子所结合的最大农药分子个数，并最终区分是否存在相互作用。此外，还探索了农药与生物大分子相互作用的时间分辨分析，将所测结果与荧光光谱法～1o3，NBT试剂盒法纠及分子模拟对接，m等方法的结果进行了比对，本方法的可靠性获得了确证。2实验部分2．1仪器与试剂Agilent1260高效液相色谱仪(USA)；6224TOF—ESI—MS质谱仪(USA)。荧光光谱仪，酶标仪(BioTek，USA)，96孔板，移液枪。牛血清白蛋白(BSA，纯度>98

5、％，Mw66kD)；超氧化物歧化酶(SOD，纯度>90％，w32kD)；甲基对硫磷，甲维盐，阿维菌素，噻呋酰胺，敌敌畏(标准品)；NBT试剂盒；乙腈，甲醇(德国默克公司)；甲酸(分析纯)；实验室用水为纯水仪(美国Millipore公司，USA)制备的二次蒸馏水。2．2溶液的配制准确称取1．98mgBSA于离心管，加入1．5mL二次蒸馏水进行溶解(20mmol／L)，于4~C存放备用；称取1．15mgSOD于离心管，加入1．15mL二次蒸馏水溶解(30p~mol／L)，然后分别稀释成3和6txmolfL的样品液，分装，于-20~C存放备用。2015-09—14收稿；2015。11-05接受本

6、文系国家自然科学基金(Nos．21205044，21302060)和高校教育部基础研究经费(Nos．CCNU14A05005，CCNU15KFY004)的资助E—mail：bx@mail．ccnu．edu．cn，zywang@mail．ccnu．edu．CFI第2期李康丽等：基于高分辨质谱技术的农药与生物大分子相互作用的分析方法2192．3质谱检测条件BSA检测浓度：20txmol／L，质荷比采集范围：m／z900—2400；SOD检测浓度：3lxmol／L(样品先加0．1％甲酸酸化)，质荷比采集范围：m／z800—1800。离子源：ESI，流动相：50％乙腈-50％二次蒸馏水(含0．1％

7、甲酸)，进样量：2L，流速：0．200mL／min。3结果与讨论3．1BSA蛋白和SOD酶的质谱检测在优化的高分辨质谱条件下，实现了对BSA蛋白和SOD酶的较好检测。由图1a可见，带+32到+64电荷的BSA分子离子，带+9到+19电荷的SOD分子离子都能被检测到(图1b)。一璺旦=00__-_××一一‘盎蛊．量．量盘蛊三一旦蛊言00一×一高‘高g．量董三互图1BSA(a)和SOD(b)的质谱图，BSA结合甲基对硫磷的质