基于核酸分子杂交的免疫芯片抗体固定新方法.pdf

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1、第41卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第2期2013年2月ChineseJournalofAnalyticalChemistry199～204DOI：l0．3724／SP．J．1096．2013．20667基于核酸分子杂交的免疫芯片抗体固定新方法沙莎殷赘高晓莲黄庄荣余挺郑晓冬(浙江大学生物系统工程与食品科学学院，杭州310058)(美国休斯顿大学化学系，德克萨斯州77004)(浙江大学农业与生物技术学院，杭州310058)摘要基于核酸分子杂交原理构建了一种新型抗体固定方法。先将抗体与寡核苷酸单链交联，再将两者的复合物与固相载体表面上的互补寡核苷

2、酸链结合，从而将抗体固定到载体的表面。在磁珠表面对该固定方法进行实验，证明了方法的可行性。以本方法构建了针对转基因BtCrylAc蛋白的免疫芯片，用Cy3标记二抗对其探针固定效果进行分析，并且在芯片上对BtCrylAc蛋白进行梯度浓度检测试验。结果表明，以本方法构建的抗体芯片，探针分布具有良好的特异性；探针层分布均匀，非特异吸附小；检测灵敏度达到0．01—0．05g／L；此外，通过杂交核酸双链的解离成功实现了芯片的再生，有助于解决传统抗体固定方法中芯片不可再生的问题。关键词免疫芯片；抗体固定；抗体一寡核苷酸复合物；核酸杂交1引言免疫芯片是实际应用中最重要、

3、研究最多的一种蛋白质芯片。其原理是将几个、几十个、甚至几万个或更多数量的抗体(或抗原)高密度排列在固相载体上形成探针层，通过探针与靶物质的结合辅以合适的检测技术来获得样品中的多项指标信息[1】。与传统的免疫分析方法如酶联免疫吸附法(ELISA)相比，免疫芯片最大的优点是能够实现并行、快速、高通量的检测；同时免疫芯片极大地节省了时间、试剂，被广泛应用于蛋白质组学研究以及疾病诊断、药物筛选、食品安全和环境安全监测等领域。抗体探针的固定是免疫芯片构建过程中的关键步骤。大量研究表明，不同的探针固定方法对免疫芯片的灵敏度和准确性等特征有明显的影响。由理想的抗体固定技

4、术构建的免疫芯片应具备以下特点：特异性良好；能够保持所固定抗体与抗原结合的能力；探针层均匀，同一芯片上各样品位点整齐均一；非特异吸附小，信噪比高等们。由于抗体空间结构复杂，目前对抗体还无法实现类似核酸芯片的体外链式扩增，不能直接在载体上制备活性抗体。一般情况下，免疫芯片的合成基于预先制备好抗体探针，再通过一定的物理或化学方法将其固定到载体的表面】。物理吸附和共价结合是最常用的两种抗体探针固定方法，但两者均存在以下问题：(1)抗体与载体表面无序结合，造成探针层均匀性差，信号均匀性也随之下降；(2)抗体在与载体表面结合的过程中易发生非特异性吸附，引起信噪比低；

5、(3)抗体与载体表面的接触易破坏抗体探针的活性部位，致使芯片的灵敏度降低；(4)合成免疫芯片后的载体不可回收利用，造成芯片的构造成本较高。较晚发展起来的基于分子间亲和力的固定方法，如生物素与链霉亲和素“，蛋白A与IgG[】等，虽在抗体的定向固定上有一定的改进，但依然不能解决芯片可再生的问题。为了克服以上缺点，本研究提出了一种基于核酸杂交的新的抗体固定方法，以改进免疫芯片的探针固定效果。本方法通过将抗体与寡核苷酸单链交联，再将两者的复合物与固相载体表面上的互补寡核苷酸链结合，从而将抗体固定到载体的表面。该方法能够利用成熟的核酸芯片合成技术首先生成均匀分布的核

6、酸探针层，而后通过核酸杂交引导抗体探针进行有序排列；同时双链核酸的引入增加了抗体与载体表面的空间距离，能有效减少载体表面上抗体的非特异性吸附，降低抗体在与载体接触过程中抗原结合活性降低的几率。此外，核酸分子固有的杂交可逆特性能够使抗体从载体表面洗脱，实现芯片的再生。本研究利用该抗体固定新方法制备了一种免疫芯片，并用于转基因BtCrylAc蛋白的检测。2012-06-27收稿；2012—1l_13接受本文系国家863计划目标导向性课题(No．2007AA10Z436)，国家自然科学基金(No．30972051)，国家转基因生物新品种培育重大专项(No2009

7、z)【080l2-o10B)资助E-mail：xdzheng@zju．edu．ca分析化学第4l卷2实验部分2．1仪器与试剂微流体DNA芯片装置(美国LCScience公司)；荧光显微镜(El本尼康公司)；Genepixa~4000B芯片扫描仪(Axon公司)；苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis，Bt)，CrylAc蛋白(分子量66kDa，中国水稻研究所)；链霉亲和素包被磁珠(BioQTechnologies公司，直径1m)；兔抗CrylAc蛋白单侈克隆抗体由杭州宜康生物公司制备；Cy3标记链霉亲和素(美国KPL公司)；Cy3标记羊

8、抗兔抗体(ProteintechGroup公司)；寡核苷酸(上海生