基于原子力显微镜的微悬臂传感器测定溶菌酶.pdf

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1、第38卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第12期2010年12月ChineseJoumalofAnal)，ficalChemistry1771一J775OOI：10．3724／SP．J．1096．2010．01771基于原子力显微镜的微悬臂传感器测定溶菌酶王颊胤1王德艳1汪国秀2胡效亚¨1(扬州大学化学化工学院，江苏省环境材料与环境工程重点实验室，扬州225002)2(UnivemityofTechnology，Sydney，AustrMia，2007)摘要提出了一种基于原子力显微镜AFM技术的微悬臂

2、检测溶菌酶的新型传感器技术。通过利用AFM激光束对溶菌酶吸附前后的微悬臂形变程度进行检测，研究了溶菌酶在正十二硫醇修饰微悬臂上的吸附。在最佳条件下，溶菌酶浓度在0．Ol一100峙／L范嗣内，其浓度的对数值与微悬臂偏转值呈良好的线性关系，相关系数达到0．998；检出限5．0ng／L。将该法用于药物制剂中溶菌酶含量的测定，获得了满意的结果。关键词溶菌酶；微悬臂传感器；原子力显微镜1引言基于原子力显微镜微悬臂梁的传感器具有尺寸小、精度高、低能耗、高灵敏度等优点，为广大研究者所关注【lJ，如应用于气体探测拉J、化学分析

3、【3'4J、生物分子检测}5扣1等研究报道。原子力显微镜的出现及微机械加工系统的发展使得微悬臂很有希望成为一种新型的生化传感器17J。溶菌酶是由巨噬细胞合成并能迅速释放到细胞外的一种重要水解酶，具有抗菌消炎、抗病毒、增强免疫力等多种药理作用旧J。另外，人体溶菌酶还可作为多种疾病的诊断指标【9J。目前，虽然对溶菌酶的应用、吸附等进行了大量研究，但对溶菌酶的定量分析并不多见，已见报道的主要有：十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳及高效液相色谱联用技术【l0

4、，酶联免疫吸附法¨1l、质谱一电化学处理方法¨21等。本研究

5、使用原子力显微镜的微悬臂作为传感器，利用原子力显微镜激光束对溶菌酶吸附前后的微悬臂形变程度作为测量手段，研究了溶菌酶在修饰微悬臂上的吸附行为，并探索出一套简便的仪器“读数系统”(Readoutsystem)。实验结果表明，在最佳吸附条件下，在0．01～100“g／L浓度范围内，溶菌酶浓度的对数值与微悬臂偏转值呈良好的线性关系，相关系数达到0．998。与传统的方法相比，此方法具有灵敏度高、使用样品量少等优点。2实验部分2．1仪器与试剂NanoScopeⅢ(a)型多功能扫描探针显微镜(SPM，美国Veeco公司)；

6、微悬臂为AFM仪器配套使用的NP-20V型氮化硅微悬臂探针(长193

7、Lm，宽20¨m，厚0．6斗m，弹性系数为0．06N／m)。悬臂上表面电子沉积两层金属层，底层为2．5nm厚的金属铬，铬层上为25nm厚的金层。溶菌酶(二次结晶，BR，国药集团化学试剂有限公司)，十二烷基硫醇(CP，国药集团化学试剂有限公司)，混合磷酸盐(上海雷磁仪器厂试剂分厂)。2．2实验方法2．2．1微悬臂的前处理微悬臂在y(H：SO。)：V(H：O：)=3：1混合液中浸泡5min(使用此溶液必须非常小心，因为其遇到有机物质会发生爆炸)，

8、然后经二次蒸馏水、无水乙醇清洗，将微悬臂在5mmol／L正十二烷基硫醇的丙酮溶液中浸泡24h，得到正十二烷基硫醇修饰的微悬臂。2．2．2微悬臂弯曲程度测量方法测量微悬臂的弯曲形变使用的是激光反射法。本方法的基本原理是用一个低功率激光二极管发出一束可见光，汇聚到微悬臂的自由端，经微悬臂表面反射的光再经以镜20lO旬3-21收稿；2010旬7-22接受本文系国家自然科学基金项目(N∞．20975091，20875081，20675071)，863计划专题项目(No．2009AA032331)资助}E—mail：xy

9、hu@yzu．edu．cn1772分析化学第38卷面反射，反射到位置灵敏探测器(PSD)收集。当悬臂梁弯曲时，反射的激光就会在探测器的表面上下移动，光点的位移正比于梁的弯曲，这个位移可由光电二极管检测。光电二极管所感受的光电流信号再通过放大器转换为电压信号输出，从而得到实验所要求的测量结果。微悬臂静止在液池溶液中的记录图像如图1A。图1B为微悬臂在一段时间内的弯曲偏转变化。本实验所有实验数据都是在Veeco公司生产的有液体流人流出管道的液池中操作获得的。实验中使用的液池整体使用石英透明玻璃制作，底端使用橡胶O型

10、圈密封。因液池的体积非常小(约50斗L)，所以当使用一次性注射器向液池中注入不I司溶液时，液池内原有溶液可被迅速替换出来，从而实现微悬臂所处溶液环境的快速转变。Sectionanalysis图1液相中原子力显微镜图像的微悬臂偏转测量(A)；(B)是(A)图的高度剖面图Fig．1AFMdeflectionimageofamicro-cantileverinsdution(A)；(B)is