《生物化学》课件-分子生物学研究方法.ppt

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1、第八章分子生物学基本研究方法（BasicTechniquesinMolecularBiology）引言基因操作也称重组DNA技术，主要包括DNA分子的切割与连接、细胞转化、凝胶电泳、核酸分子杂交、核酸序列分析以及基因人工合成、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。基因工程是指在体外将核酸分子插入各种载体分子中，构成遗传物质的新组合，并使之进入新的寄主细胞内，进行持续稳定的繁殖和表达。从20世纪中叶开始，分子生物学研究得到高速发展，主要原因之一是研究方法，特别是基因操作和基因工程技术的进步。本章的主要内容第一节

2、重组DNA技术回顾第二节DNA的基本操作技术第三节RNA的基本操作技术第四节基因克隆技术第五节基因芯片技术第六节蛋白质组学及其研究技术第一节重组DNA技术回顾(ReviewofRecombinantDNATechnique)第八章分子生物学基本研究方法一、什么是重组DNA技术？重组DNA技术（RecombinantDNATechnique）又称为基因克隆（GeneCloning）或分子克隆（MolecularCloning）技术。是按照人们意愿，在体外对DNA分子进行重组，再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和繁殖，

3、以获得该DNA的大量拷贝。重组DNA技术包括了一系列的基因操作步骤。二、重组DNA技术的基本步骤①目的DNA的获得与载体的制备；②目的DNA与载体的连接；③重组DNA导入受体细胞；④重组DNA的筛选和鉴定；⑤目的DNA的表达及表达产物的检测与分离纯化。三、重组DNA技术的四大要素目的DNA载体（Vector）工具酶宿主细胞（一）目的基因（外源基因）的获取获得需要的目的基因常用的方法：1、分离的基因DNA片段或基因；2、mRNA逆转录合成的cDNA；3、化学合成人工目的基因；4、PCR体外扩增的DNA片段。（二）载体载体（V

4、ector）：是指能运载外源性DNA进入宿主细胞，并能进行自我复制的DNA。克隆载体(cloningvector)：为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体。表达载体(expressionvector)：为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体。（1）按功能分类：整合载体（integratedvector）:为把一个基因插入到染色体中而特意设计的载体。1、载体分类（2）进入受体细胞类型分类：穿梭载体（Shuttlevector）：是能够在两类不同宿主中复制、增殖和选择的载体。如有些载体既能在原核细胞

5、中复制又能在真核细胞中复制，或能在E.coli中复制又能在革兰氏阳性细菌中复制。原核载体真核载体（3）按载体来源分类：噬菌体载体（入噬菌体、M13噬菌体）质粒载体柯斯质粒（Cosmid）细菌人工染色体（BacterialArtificialChromosome，BAC）P1源的细菌人工染色体（P1-derivedArtificialChromosome，PAC）酵母人工染色体（YeastArtificialChromosomeYAC）病毒载体哺乳动物人工染色体（MammalArtificialChromosome，MAC）

6、人类人工染色体（HumanArtificialChromosome，HAC）植物人工染色体（PlantArtificialChromosome，PAC）常见载体的种类和特征载体类型受体细胞结构插入片断举例质粒E.coli环状＜9kbpUC18/19,T-载体等λ噬菌体E.coli线状9–24kbΛgt系列丝状噬菌体E.coli环状＜10kbM13mp系列柯斯质粒E.coli环状35-45kbpJB8,pWE15/16BACE.coli环状~300kbPeloBAC系列PACE.coli环状100-2000kbPCYPAC1

7、YAC酵母细胞线性染色体100-2000kbMAC哺乳类细胞线性染色体＞1000kb病毒载体动物细胞环状SV40载体，昆虫杆状病毒载体穿梭载体动物细胞和细菌环状pSVK3质粒，PBV,Ti质粒2、载体应当具备的条件（1）能自主复制。容易获得大量的重组的DNA分子；（2）具有合适的外源DNA插入的位点（克隆位点或限制性内切酶的切点）。便于接纳不同的DNA片段。（3）具备可供选择的遗传标记。便于进行重组体筛选和鉴定。（4）载体本身应尽量小。不含或尽量少含多余的DNA部分，这样可以容纳较大的外源DNA。（5）在宿主细胞内的稳定性

8、高。多克隆位点Ori复制起始点遗传标记AmpMCS载体（三）工具酶重组DNA实验中常见的主要工具酶我们的基本目的是：把外源基因与载体连接在一起形成重组DNA分子，最少需要以下两类工具酶：1、准确切割DNA分子的工具（“分子手术刀”）------限制性内切酶2、DNA片段的连接工具（“分子缝合针”）---