分子生物学研究方法2011ppt培训课件

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1、分子生物学研究方法本章将在回顾重组DNA技术史上主要事件的基础上，讨论DNA操作技术、基因克隆的常用载体系统以及基因的分离与鉴定等环节。DNA分子的切割与连接核酸分子杂交凝胶电泳细胞转化核酸序列分析基因的人工合成基因操作基因的定点突变PCR扩增等核心技术2021/10/525.1重组DNA发展史-------三大成就：1.40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；1928FrederickGriffith&1944OswaldAveryTrans

2、formationofStreptococcuspneumoniae(肺炎链球菌)1957年，HeinzFraenkel-Conrat和B.Singre的杂合病毒实验1952年Hershey和Chase证实噬菌体DNA侵染细菌实验2021/10/532.50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；X-raysourceCrystallizedDNARosalindFranklinMauriceWilkinsPhotographicfilm1953-F

3、ranklin&Wilkins2021/10/541920年7月25日，罗莎琳生于伦敦的一个犹太家庭。1942年，她又到英国煤炭应用研究协会从事碳纤维研究。1951年，伦敦大学国王学院（KingsCollege）的约翰•伯纳尔（JohnRandall）邀请罗莎琳到他那里工作。他的一位研究生对DNA分子作了初步的X衍射试验，伯纳尔希望她对实验结果进行深入分析。1952年，罗莎琳得到了B型DNA分子清晰的X衍射图像（DNAPhotograph51），这是一张具有里程碑意义的图像。1953年1月，威尔金斯

4、把这张图片展示给了沃森和克里克。1962年，沃森、克里克和威尔金斯分享了诺贝尔生理学奖，然而他们在获奖后的演讲中也没有提到罗莎琳。1958年4月，罗莎琳被病魔夺去了年仅38岁的生命。2021/10/553.50年代末至60年代，相继提出了"中心法则"和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。JacobandMonod2021/10/56两大技术保证：1.DNA的体外切割和连接1962年Arber发现限制性核酸内切酶，1967Gellert发现了DNA连接酶DNAligase

5、covalentlylinkstwoDNAstrandsRestrictionenzymeRestrictionenzymeLigaseLigase3’5’3’5’但是，如果没有分离和富集单一DNA分子的技术，科学家就无法对这类物质进行直接的生化分析。2021/10/571972-PaulBerg,ProducedfirstrecombinantDNAusingEcoRIEcoRIrecognitionsitesλphageDNAEcoRIcutsDNAintofragmentsStickyendS

6、V40DNAThetwofragmentssticktogetherbybasepairingDNAligaseRecombinantDNA2021/10/58几百碱基对长短的DNA片段适于进行精细的物理图谱以及DNA序列分析等；因此常选用切点较多的识别位点为4个核苷酸序列的酶。这在建立基因组文库常用的方法识别位点为6个核苷酸序列的限制性内切酶通常产生1一10kB长短的限制性寸段，适于进行较长的DNA分子的物理图谱和包括内含子．结构基因以及调控序列在内的完整基因的克隆；2021/10/59重组DNA

7、实验中常见的主要工具酶酶      类功     能限制性核酸内切酶识别并在特定位点切开DNADNA连接酶通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片段连接成一个DNA分子DNA聚合酶I（大肠杆菌）按5'到3'方向加入新的核苷酸，补平DNA双链中的缺口反转录酶按照RNA分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合成DNA链多核苷酸激酶把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5'-OH末端（进行末端标记实验或用来进行DNA的连接末端转移酶在双链核酸的3'末端加上多聚单核苷酸DNA外切酶III从DNA链的3'末端逐个切除单核苷酸λ噬

8、菌体DNA外切酶从DNA链的5'末端逐个切除单核苷酸碱性磷酸酯酶切除位于DNA链5'或3'末端的磷酸基团到目前为止，科学家已经几乎能随心所欲地把任何DNA分子切割成一系列不连续的片段，再利用凝胶电泳技术将这些片段按照分子量大小逐一分开，以供下一步研究。2021/10/510DNA片段在体外不具备自我复制能力，要想得到足够量和足够纯度的DNA，必须将它们连接到具备自主复制能力的DNA分子上（载体上），并转入寄主细胞中进行繁殖。这就是基因克隆，或分子克隆。2021/10/