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1、曲霉菌实时荧光定量PCR检测体系的建立研究生导师学院Theestablishmentofreal-timefluorescentquantitativePCRassaysforthedetectionofAspergillus21.研究背景2.研究目的3.实验路线4.第一部分曲霉菌标准株的培养与DNA提取5.第二部分曲霉菌FQ-PCR检测体系的建立及评价6.结果与讨论7.全文结论目录3研究背景4研究背景曲霉菌属(aspergillus)：属丝状真菌，是一种常见的条件致病性真菌，好发于免疫低下及缺陷的人群在免疫缺陷、
2、恶性肿瘤、器官移植患者中的感染率呈上升趋势YuY,AmJperinatol,2013MelladoE.RevlberoamMicol,2013Armstrong-JamesD.Trendsinmicrobiology,2014KauffmanCA.Fungalinfections.2013研究背景地方性真菌1%地方性真菌3.5%1990年-1999年2000年-2008年leukemiapatients,M.D.AndersonCancercenter,CID,2010,50:405-15杨尚伦.急性淋巴细胞白血病
3、真菌感染临床特点分析[J].实用癌症志,2014(9):1182-1184.2008年-2013年6研究背景侵袭性曲霉菌病（InvasiveAspergillosis,IA）：是感染曲霉菌所引起的一种慢性霉菌病最常见的致病性曲霉菌：烟曲霉菌、黄曲霉菌土曲霉菌、黑曲霉菌ArvanitisM.ClinicalInfectiousDiseases,2015Kwon-ChungKJ.PLoSPathog.20137研究背景培养直接涂片镜检影像学GM实验组织病理FQ-PCR曲霉菌辅助检查方法直接涂片和培养阳性率低取材有创、困
4、难真菌感染诊断的研究热点缺乏特异性，特征性表现出现晚灵敏性、特异性高，但易受影响，出现假阳性及假阴性FQ-PCR技术在病毒感染的诊断检查技术方面已经成熟目前没有标准的用于临床的曲霉菌FQ-PCR检测试剂盒（CFDA检索）前期已成功建立了念珠菌及新型隐球菌实时荧光定量PCR检测体系8研究背景LauAMethodsMolBiol,2013AittakorpiA.Journalofclinicalmicrobiology,2012建立曲霉菌实时荧光定量PCR检测体系，关键在于曲霉菌DNA的提取和特异性引物探针的设计研究背
5、景10研究背景曲霉菌DNA提取方法史俊艳.临床常见曲霉菌体外药物敏感性及分子生物学鉴定方法研究[D].中国协和医科大学,2010.Klimek-OchabM.FoliaMicrobiologica,201111研究背景曲霉菌DNA提取方法的选取物理方法液氮研磨法：次之，已有商品化试剂盒玻璃珠机研磨法：最佳，但耗时长超声波降解法化学方法CTAB缓冲液加微波法酶消化法：快速有效高渗震扰法Klimek-OchabM.FoliaMicrobiologica,2011RittenourWR.JournalofEnvironm
6、entalMonitoring,2012O'ConnorL.US20110311969[P].2011理论18SrDNA、28SrDNA、5.8SrDNA、ITS1、ITS2实际A.fumigatuseasLgene、A.flavusaflEgene、A.terreusCBMAI0193gene、A.nigeralpha-1,3-glucansynthasegene研究背景GadeL,EukaryotCell,2013OgawaM.GraefesArchClinExpOphthalmol,2012RobinsonS
7、L.Mycologia,2012YuquanX.Applied&EnvironmentalMicrobiology,2013扩增靶序列的选取1.探针不保守2.引物Tm值不达要求13初步设计合成的四种曲霉菌引物探针序列（每种2套）菌种引物探针序列Tm值(℃)A.fumigatus1F：CCTCCAGCCAAACCTGAACTTP：GGCACCAGAACCTCCCGCTGAAAATGR：TTCGTCATTGTTTAGAGCCACCT60.167.460.2A.fumigatus2F：AGCCTCGGGATGTGGTTC
8、AP：CTGGACCCATGACCAATCTTCTGTGTGR：TCGTCGGTCACTTTCCTTGC61.963.362.5A.flavus1F：TGGGCTGTTTTGCTGTATGGTTP：AATTCGTCTCATCAAAGAGGCATCCTCGCR：TGCTGAAGGACTAAAAGGACAAGG62.164.660.3A.flavus2F：ATC
