分光光度技术.doc

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1、实验一分光光度技术%1.概念分光光度法(Spectrophoto莒raphy),又称为比色法，它是利用物质特有的吸收光谱來鉴别物质或测定其含量的一项技术。有色溶液对光线有选择性的吸收作用，不同物质由于其分子结构不同，对不同波长的光的吸收能力不同，因此，每种物质都具有其特异的吸收光谱。比色法只限于可见光区，分光光度法可扩展到紫外光区和红外光区。使用的光谱范围200-1000nm紫外光区：2()0-400nm可见光区:400-760nm红外光区：760-1000nm%1.基本原理物质的吸收光谱与它们的本身的分子结

2、构有关，不同物质由于其分子结构不同，对不同波长光线的吸收能力也不同。每种物质都具有特定的吸收光谱，在一定条件下，其吸收程度与该物质浓度成正比，因此可利用各种物质不同的吸收光谱及其强度，对不同物质进行定性和定量分析。分光光度法根据的原理是Lambert—Beer定律，该定律阐明了溶液对单色光吸收程度与溶液浓度及溶液厚度之间的关系。1.朗伯(Lambert)定律：当单色光通过一吸收光的介质时，其光强度随吸收光介质的厚度增加而成指数减少，即I/I0=e_K,Llot入射光强度，/：出射光强度，L：介质的厚度&自然对

3、数的底，即2.718Ki：溶液的吸光率In(Io/I)=Kd换算成常用对数式，即log(Io/I)=0.4343-Kil令K=0.4343・Kl则log(IO/I)=K1此处以K为吸光率也就是说：在溶液浓度不变吋，溶液对光的吸收随溶液厚度的增大而增大。1.比尔(Beer)定律：单色光通过一光吸收介质时，光强度随介质浓度壇长而成指数减少，即I/Io=e_K2LC：溶液浓度log(Io/I)=KC也就是说：溶液厚度不变时，溶液对光的吸收随溶液浓度的增大而增大。2.Lambert—Beer定律如果同吋考虑吸收溶液的

4、浓度和厚度对光吸收的影响，将以上两式结合，则得出log(Io/I)=KC1令T二(I/I())A=log(I()/I)则A=KC1A为吸光度，T为透光度彳(L-mol-1•cnT)是一常数，即削光系数，也叫摩尔吸光度；%1.计算1•标准管法(标准比较法)用一己知浓度的测定物按测定管同样处理显色，读出吸光度，在根据公式计算。Ai二K

5、C】L

6、A2=K2C2L2A】：已知浓度标准管A2:未知浓度测定管A

7、/A2=(K]C]L

8、)/(k2c2l2)因为使用的比色杯径长相同，即L!=L2,所以上式可改写为：A

9、/A2

10、=(K]C

11、)/(K2C2)又因另标准液和测定液小禹溶质为同一物质，所以K值相同，即：K

12、=K2所以上式可改写为A

13、/A2=C]/C2所以C2=(A2/A1)C]实验屮，由于比色皿本身和溶剂也会产生一定的光吸收，所以设置一个空白管,即其屮除了待测溶质以外,其他的成分完全相同。以空白管对准光路对仪器调零,消除非待测物的吸收，所测值即为待测物的光吸收。2.标准曲线法制备一系列己知不同浓度的测定物溶液，按测定管同样方法处理显色，分别注意事项：%1.标准曲线是一过原点的直线%1.标准曲线范围在被测定物质浓度的一半到两

14、倍0间，并且A（吸光度）在0.05一1.0之间为宜。%1.标准曲线仅供短期使用，应在曲线上表明操作仪器，操作者及操作吋间%1•测定标准曲线及样品需使用同一台仪器实验屮，由于比色皿本身和溶剂也会产生一定的光吸收，所以设置一个空白管，即其屮除了待测溶质外，其它的成分完全相同。以空白管对准光路对仪器调零，消除非待测物的吸收，所测值即为待测物的光吸收。三.仪器的结构1.定义：对某一波长的光吸收值（吸光度）进行测定的仪器称为分光光度计。2.分类：根据所测光谱范围分为：紫外、可见、红外分光光度计及万用（全波段）分光光度计

15、。3.结构组成光源单色器□□狭缝吸收池检测系统%1光源：要求能提供所需波长范囤的连续光谱，稳定而有足够的强度。常用光源有：鸭灯或卤鸭灯：工作范围360—lOOOmn,用于可见光区，近紫外光区和近红外光区氢灯或氟灯：工作范围150-400nm,可作紫外光分光光度计的光源%1分光系统（单色器）：把混合光分解为单一波长光的装置，多用棱镜或光栅作为色散兀件，将不同波长的光分开%1吸收池（比色皿、比色池）：用来盛待测溶液。一般用玻璃、石英制成。小于330nm的光不能用玻璃比色皿，所以紫外吸收吋要用石英比色皿。%1检测器

16、：光电池、光电管、光电倍增管组成%1测量装置：以电流表、波长分度盘和测量读数盘的形式输出测量结果，现代的仪器长附有自动记录器，可自动描出记录曲线。蛋白质化学实验—*•双缩月尿测定蛋白含量R.R2IrNH.—C—CO—NH—C—COIIHH肽键结构OIINH.—C■oIINH—C—NH.■双缩J］尿结构1・原理：蛋白分子屮含有许多肽键，与双缩腺结构类似，在碱性溶液屮与CJ+结合形成紫色化合物，此反应称