测定酶活性浓度的两大类方法.pdf

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1、测定酶活性浓度的两大类方法一、固定时间法（取样法）前面已经提到，早期临床实验室测酶活性时常使用比色法，先让酶与底物在一定温度下作用一段固定的时间，然后停止酶反应，加入试剂进行化学反应呈色测出底物和产物的变化。由于比色法灵敏度较低，或由于手工操作不易控制好，常定在30分钟左右。历史上这类方法常被命名为“终点法”、“二点法”、“固定时间法”和“取样法”。大多数文献使用“固定时间法”。此命名指出了用这类方法测酶活性浓度，必须保证酶和底物在所选定的温度下作用时间要很精确，否则将引起较大误差。但“取样法”的命名更具有特征性。因它指出此类

2、方法和下面将提到的另一类连续监测法相比较，最基本一点的是此类方法停止反应后才测底物或物的变化。很难进行连续监测，而另一类方法则不需停止酶反应，就可测定反应物的变化，很容易观察到反应的整个过程。后一类方法开始于50年代，Warburg首先用分光光度计。在340nm处直接监测到反应物NADH的动态变化过程。由于不停止酶反应，不需添加其它呈色试剂。测定方法简单，结果准确，逐步取代了“取样法”成为目前测酶活性的主要方法。由于经历了一个发展过程，命名比较混乱而且大部分不甚确切，IFCC建议命名为“连续监测法”，不用目前广为流行的“动态法

3、”术语。其原因是目前测酶活性浓度方法都是基于化学反应。图17-6是一个典型的化学反应过程。图17-6动态和平衡概念的示意图可以看出整个反应过程，可以大致分为二个时期。一开始为动态期，化学反应按一定速度进行，反应物浓度随时间而变化，且变化程度不断变小，到一定时间。化学反应或者达到平衡，或者反应达到终点，此时反应速度为零，反应物浓度不变。最近IFCC文件按所用方法所测定的反应是在达到平衡前还是平衡后。分别命名为动态法或平衡法。一般文献往往将后一类方法称为终点法。二、连续监测法与反应进程的分析从这个权威性的方法分类来看，前面所提到的

4、二类测酶活性浓度方法都应归纳为动态法。目前广为流行的“动态法”命名显然是不确切的或者是不合适的。应该更多采用IFCC文件中建议的“连续监测法”命名。从酶反应曲线来比较此二类方法。图17-7是一个典型酶反应过程。图17-7酶促反应中基质[S]、产物[P]和反应速率V在不同时间变化的模式图在酶作用下，底物[S]浓度不断下降，随之有相应产物[P]产生。不少酶在反应一开始的阶段，由于各种因素影响，反应速度较慢，称为延滞期，随后在过量浓度的底物存在条件下，酶反应以恒定的速度进行，不受底物浓度变化的影响，这段反应称为线性反应期或零级反应期

5、。随时间延长，反应速度除与酶量有关，还与底物浓度有关。即v＝k(a－x)，式中a为原来底物浓度，x为消耗的底物浓度，如反应物浓度项上指数为1，称为一级反应，假如反应速率受二种或二种以上物质浓度的影响，则各个反应物浓度项上指数总和作为反应级数，可以分别为一级、二级或多级反应，总的将这段反应时期称为非线性反应期。很明显如测反应速度的目的是为了从此推算出酶含量的多少，则只有测线性反应期的反应速度才能作到此点。在延滞期、非线性期测的结果不准确，一般是偏低的。取样法由于方法学上的限制，一般只测二管：一为没发生酶反应的对照管，另一管测酶作

6、用一段时间后反应物的变化，实际上测得是平均速度，而且二管间隔时间都较长，在半小时左右，图17-8中t0，t分别代表不同时间二管反应物的量，虽然从t到t0反应物变化量是相同的。但实际反应过程是多种多样的。只有当反应如曲线A时，用“固定时间法”才能测出真实的酶活性，实际工作中是很少见的，图中曲线B代表了最常见的反应情况，在一个很短的线性反应期后在大部分测定期间内主要为非线性反应期。曲线C说明在测定期间包括了延滞期，曲线D则不仅包括了延滞期，还包括非线性期，在这些反应中如用固定时间法来测定，结果是不够准确的，一般是偏低的，而且酶浓度

7、愈高，偏离程度愈大。假如从上节叙述中得出一个重要结论：即在设计和选择测定酶活性浓度方法时必须是在“最适条件”下测定最大反应速度。那么从这段叙述中可得出一个对上述结论一个很重要的补充，即所测的最大反应速度还应该是初速度即V0。理论上的V0在实际工作中是不存在的，必须让酶和底物作用一段时间，消耗掉一定量的底物，才能测出反应速度，一般说，如消耗底物在5％内所测到的反应速度都可认为是初速度，如底物浓度很高时，底物消耗在20％以内的反应往往还在线性反应期。连续监测法能满足上述重要要求。由于不需停止酶反应。很容易得到整个酶反应曲线，然后根

8、据反应曲线情况，避开延滞期和非线性反应期，只在线性反应期测定最大反应初速度。同时由于分光光度法的高灵敏度，自动生化分析仪的高精密度，连续监测法能在很短时间，甚至在1分钟反应时间，准确测定反应速度，从而求出准确的酶活性浓度。“固定时间法”测定时间长达30分钟，很难满足上述方法学