肝素的提取精制和亚硝酸法制备低分子肝素的研究.pdf

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1、跨西料技大学万方数据论文题目：肝素的提取精制和亚硝酸法制备低分子肝素的研究学科门类：工学一级学科：食品科学与工程培养单位：食品与生物工程学院硕士生：黄满红导师：宋宏新教授2016年5月万方数据Extraction，PurificationofHeparinandPreparationofLowMolecularWeightHeparinbyNitrousAcidAThesisSubmittedtoShaanxiUniversityofScienceandTechnologyinPartialFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeofMasterof

2、EngineeringSciencenBySupervisor：Prof．HongxinSongMay2016万方数据肝素的提取精制和亚硝酸法制备低分子肝素的研究摘要肝素是一种由动物结缔组织的肥大细胞产生的粘多糖，主要存在于猪小肠粘膜和肝、肺脏等组织细胞中。目前，我国主要以肉制品企业的副产物．猪小肠粘膜提取肝素，大多小企业技术设备落后，缺乏专业技术人员，肝素产品良莠不齐，多以粗品肝素的原料药出口为主，提高产品质量和加工精度，延长产业链提质增效已迫在眉睫。肝素有很好的抗凝血作用，它是预防和治疗深静脉血栓形成(DVT)等血栓栓塞性疾病的首选药物。肝素作为抗凝剂临床应用已有70多年，但由于其容

3、易引起出血的副作用而限制其临床应用。而低分子肝素相比肝素有许多优点，比如：在低水平抗凝作用时可以产生良好而持久的抗血栓作用、出血副作用小、血浆半衰期长等。但是我国目前对低分子肝素的研究仍处于初级阶段，低分子肝素的使用主要依靠进口。因此本课题对肝素钠的制备技术进行研究，旨在改善传统生产工艺，提高肝素产品质量。同时研究亚硝酸法制备低分子肝素的工艺参数，为低分子肝素的生产提供一定的理论依据。主要研究结果如下：1．肝素钠效价的检测研究。通过羊血浆法、生色底物法和天青A法测定了两厂家的肝素钠效价分别为：148U／mg和164U／mg，145．5U／mg和156．8U／mg，145．5U／mg和16

4、1．4U／mg。三种方法都能用于测定肝素钠效价，且测定结果可靠，基本一致。在应用中应结合实际条件和各方法的优缺点进行选择。天青A法用于试验快速测定，另外两种方法基于抗凝活性的检测主要用于终产品药效检测。2．粗品肝素钠的制备研究。以肝素钠效价、吸附率和肝素得率为评价指标，研究了肝素钠制备的酶解、树脂的吸附和解吸三个关键步骤，分别考察了温度，pH值、盐浓度、时间等对于提取工艺的影响，在单因素试验基础上通过正交试验取得粗品肝素钠制备的最佳条件是：a、酶解：小肠粘膜与提取液的料液比1：8，盐浓度0．5mol／L，胰蛋白酶添加量0．1％，酶解液pH值为8．8，酶解温度60℃，酶解时间3．5小时。b

5、、吸附：D254树脂添加量2．8％、吸附温度55℃，盐浓度0．2mol／L，吸附液pH值8．5、吸附时间7小时。c、洗脱：洗脱液盐浓度3．0mol／L、洗脱液pH值8．5、洗脱温度45℃、洗脱时间3．5小时，洗脱2次。以此方法制备得到的粗品肝素钠效价为83U／mg，得率2．12％，蛋白质含量19．26mg／g，产品色泽为淡黄色。达到了最终精制肝素钠对原料的要求，并且产量稳定高效，取得了满意的效果。万方数据3．粗品肝素钠的精制研究。粗品的精制技术中，主要分析了一次氧化法、二次氧化法及酶法和酶法结合一次氧化法等不同方法对于粗品肝素钠精制结果的影响，分析了蛋白质含量，效价，杂质紫外吸收OD26

6、0、OD280，及产品颜色等指标。并最终确定了以酶法(即胰蛋白酶量0．1％、酶解温度40℃、酶解pH值7-9、酶解时间5h)结合H202一次氧化法(即H202量1．5％、氧化pn值8．5．9．5、氧化温度25℃、氧化时间15h)的方式精制肝素钠，最终产品蛋白质含量为6．13mg／g，效价为139．5U／mg，OD260、OD：so均达到了中国药典的规定，并且经傅立叶变化红外光谱仪的分析，光谱图与肝素钠标品的峰形基本一致，产品为白色，方法稳定，效果良好。4．亚硝酸法制备低分子肝素(LMWH)的研究。选取了四个影响因素：亚硝酸浓度、降解温度、溶液pH值和降解时间，对降解反应产物中的LMWH用

7、聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳进行分析比较，确定的亚硝酸法制备低分子肝素的最佳工艺参数为亚硝酸钠浓度0．6％，溶液pH值2．6，降解温度25℃，降解时间4．0h，在该条件下制得LMWH的得率为45．4％。5．低分子量肝素的性质研究。通过羊血浆法，生色底物法测定低分子肝素的效价分别为185U／mg，抗FXa效价=122．5U／rag、抗FIIa效价=43．1U／mg，抗FXa／抗FIIa----2．8>1．5，符合2015版中国药典要