宫颈癌RASSFIA基因启动子与第1外显子区甲基化状态的研究.pdf

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1、宫颈癌RASSFIA基因启动子与第1外显子区甲基化状态的研究中文摘要人类乳头瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)的发现使得宫颈癌成为迄今病因最明确的一种癌症，肿V感染干扰经典抑癌基因p53及RB的作用也已确认。HPV也可能通过诱导某些抑癌基因启动子区CpG岛高甲基化而引起该基因表达沉默参与宫颈癌的发生发展，但是HPV如何诱导宿主基因甲基化以及作用于那些基因有待于深入研究。目的探讨4种宫颈癌细胞系及宫颈癌组织中RASSFIA基因启动子及第1外显子区甲基化状态，明确甲基化转移酶抑制剂5．氦杂．2’．脱氧胞苷(5．Aza．2’

2、deoxycytidine，5-Aza．dc)对宫颈癌细胞系RASSFIA基因启动子及第1外显子区甲基化状态及转录表达的影响。方法采用甲基化特异性PCR(Methylation．SpecificPC＆MSP)和基于亚硫酸氢盐修饰的基因组测序法(Bisulfitegenomicsequencing，BGS)检测5-Aza-dc处理前后4种宫颈癌细胞系、宫颈癌组织以及正常宫颈组织中RASSFIA基因启动子及第1外显子区甲基化状态。同时应用实施荧光定量PCR(Real．timePCR)检测RASSFIA基因的转录表达情况。结果QMSP检测RASS

3、FIA基因启动子及第l外显子区甲基化状态结果显示2种HPV阳性宫颈癌细胞系HeLa,Caski呈U型，2种HPV阴性宫颈癌细胞系HT-3，C．33A呈M型。经5-Aza-dc处理后，HT-3，C．33A细胞系M+U型，而2种HPV阳性细胞系无明显变化。②宫颈癌组织和正常宫颈组织中RASSFIA基因启动子及第1外显子区的甲基化率分别为6％(3／48)和0％(0／15)，统计学分析表明，宫颈癌组织RASSFIA基因启动子的甲基化率与正常宫颈组织比较无统计学意义(FISH精确概率，尸：O．2691)；HPV阳性宫颈癌组织和细胞系以及HPV阴性宫颈

4、癌组织和细胞系中RASSFIA基因启动子与第1外显子的甲基化率分别为2．17％(1／46)和66．7％(4／6)，统计学表明，两者之间甲基化率差异有统计学意义(FISH精确概率，P=O．00027)。在HPV感染的宫颈鳞状细胞癌中未发现RASSFIA基因启动子及第1外显子区的甲基化。仅有1例HPV感染的宫颈腺癌中存在RASSFIA基因启动子及第1外显子区的甲基化。⑧BGS结果显示RASSFIA基因启动子及第1外显子区的64个CpG位点基化状态，2种HPV阳性细胞系HeLa及Caski除个别位点发生甲基化外，其余位点均未发生甲基化；而2种HP

5、V阴性宫颈癌细胞系HT-3及C．33A则表现为几乎所有位点的甲基化。两种不同浓度5-Aza-dc作用于HT-3和C．33A细胞系后，其甲基化程度降低。1例HPV阳性、1例HPV阴性宫颈腺癌组织及1例HPV阴性的宫颈鳞癌呈高甲基化状态。⑤方差分析显示，两种不同浓度5-Aza-dc作用HPV阴性宫颈癌细胞系HT-3及C．33A在后，RASSFIA基因的转录表达水平差异具有统计学意义(晟订．3=85．598，P=0．00；Fc-33A：12．476，P=0．00)。而在HPV阳性宫颈癌细胞系Caski中，两种不同浓度5-Aza．de作用前后，RA

6、SSFIA基因的转录表达水平无统计学意义陬。Ski=1．080，P=0．398)。⑥宫颈癌组织与正常宫颈组织中RASSFIA基因的转录表达水平无显著性差异忙1．908，P=0。069)；HPV阳性和HPV阴性宫颈癌组织中RASSFIA基因的转录表达水平也无统计学意义(仁．0．085，P=0．756)。结论q)i-iPV阳性和HPV阴性宫颈癌细胞系中RASSFIA基因启动子及第l外显子区甲基化状态不同。@RASSFlA基因启动子及第1外显子区的高甲基化可抑制该基因表达；5-Aza-dc处理可使RASSFlA基因启动子及第1外显子区去甲基化，重

7、新激活基因的表达。③仅少数宫颈癌组织中RASSFIA基因启动子及第1外显子区的高甲基化，在HPV感染的宫颈鳞状细胞癌中未发现RASSFIA基因启动子及第l外显子区的高甲基化。@RASSFIA基因可能通过遗传学机制或其他表观遗传学机制参与宫颈癌的发生发展，其发挥作用途径及其机制未完全明确，HPV感染与宫颈癌中RASSFIA基因低甲基化之间的关系仍需进一步深入研究。硕士研究生：汪姗姗(妇产科)指导老师：王言奎教授关键词：人乳头瘤病毒；DNA甲基化；RASSFlA(RAS相关区域家族1A)基因；宫颈肿瘤；5-Aza．de；T．A克隆Studyon

8、methylationstatusandexpressionofRASSFIAgenepromoterandexon1inCervicalCarcinomaAbstractHig